S.N. אלנסקי, ל. יו. קוקאייבה, נ.וו. סטאציוק, יו.ט. דיאקוב
מבוא
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - הגורם הסיבתי של הדלקת המאוחרת, המחלה החשובה ביותר מבחינה כלכלית של תפוחי אדמה ועגבניות - משך תשומת לב רבה של חוקרים ממדינות שונות במשך יותר ממאה וחצי. פתאום הופיע באירופה באמצע המאה ה -XNUMX וגרם למגיפת תפוחי אדמה שנותרה בזיכרון של דורות רבים.
עד עכשיו הוא מכונה לעתים קרובות "הפטרייה של הרעב האירי". כמעט מאה שנה לאחר המגיפות הראשונות התגלו מיני תפוחי אדמה מקסיקניים פראיים העמידים בפני דלקת מאוחרת, פותחו שיטות לחצותם עם תפוחי אדמה מעובדים (מולר, 1935), והושגו הזנים הראשונים העמידים בפני דלקת מאוחרת (פושקרב, 1937). עם זאת, זמן קצר לאחר תחילת גידולם המסחרי, הצטברו גזעים של פתוגן הדלקת המאוחרת שהיו ארסיים לזנים עמידים. והכנסת גנים עמידים חדשים מתפוחי אדמה מקסיקניים פראיים לזנים החלה לאבד במהירות את יעילותם.
כשלים בשימוש בהתנגדות מונוגנית (אנכית) אילצו את המגדלים לחפש דרכים מורכבות יותר לניצול התנגדות פוליגנית (אופקית) לא ספציפית. בשנים האחרונות, גזעים אגרסיביים ביותר החלו להצטבר באוכלוסיות בודדות של הטפיל, מה שגרם לשחיקה של התנגדות אפילו לא ספציפית. הופעתם של זנים עמידים בפני קוטלי פטריות גרמה לבעיות בשימוש בכימיקלים להגנה על תפוחי אדמה.
בשל ההבדלים המשמעותיים בין oomycetes ופטריות בהרכב הכימי, ultrastructure וחילוף חומרים, קוטלי פטריות, במיוחד אלה מערכתית, המשמשים להגנה על צמחים מפני מחלות פטרייתיות רבות, אינם יעילים נגד oomycetes.
לכן, בהגנה הכימית מפני דלקת מאוחרת, נעשה שימוש בהתזה מרובה (עד 12 פעמים בעונה ומעלה) בתכשירי מגע בעלי מגוון רחב של פעולות. צעד מהפכני היה השימוש בפנילמיד, הרעיל לאומיציטים ומתפשט באופן שיטתי בצמחים. עם זאת, השימוש הנרחב בהם הוביל במהירות להצטברות של זנים עמידים באוכלוסיות פטרייתיות (Davidse et al., 1981), מה שסיבך את הגנת הצומח באופן משמעותי. P. infestans הוא למעשה הטפיל היחיד של האזור הממוזג, שלא ניתן לנטרל את הפגיעה בחקלאות אורגנית ללא שימוש באמצעי הגנה כימיים (Van Bruggen, 1995).
האמור לעיל מסביר את תשומת הלב העצומה שהקדישו חוקרים ממדינות שונות לחקר אוכלוסיות P. infestans, את הדינמיקה של שפע והרכבם הגנטי, כמו גם את מנגנוני השונות הגנטיים.
מחזור חיים של R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans מפתח תפטיר בין-תאי עם haustoria בתוך עלי תפוחי אדמה. ניזון מרקמות העלים, הוא גורם להיווצרות כתמים כהים, שמשחירים ונרקבים במזג אוויר רטוב. בתבוסה חזקה כל העלה מת. לאחר תקופת האכלה נוצרים תולעים על התפטיר - sporangiophores - הצומחים החוצה דרך הסטומטה. במזג אוויר רטוב הם יוצרים פריחה לבנה סביב הכתמים בצד התחתון של העלים. בקצות הספורנגיופורים נוצרים זואספורנגיה בצורת לימון, אשר מתנתקים ונישאים על ידי ריסוס של גשם (איור 1). נפילה לטיפות מים על פני עלה של תפוח אדמה, נובעת ספורנגיה עם 6-8 זואוספורות, אשר לאחר תקופת תנועה מעוגלות, מכוסות בקליפה ונובטות בצינור נבט. הנבט חודר דרך הסטומטה לרקמת העלה. בתנאים מסוימים, sporangia יכול לצמוח בצינור גדילה ישירות לרקמת העלים. בתנאים נוחים, הזמן מהידבקות ועד להיווצרות סיבוב חדש הוא 3-4 ימים בלבד.
לאחר שהיו על הקרקע ומסוננים דרך האדמה, sporangia מסוגלים להדביק פקעות. פקעות שנפגעו קשה נרקבות במהלך האחסון; במושפעים חלשים, הזיהום עשוי להימשך עד העונה הבאה. בנוסף, הגורם הסיבתי של הדלקת המאוחרת יכול להימשך בחורף בצורה של אוספורות (נבגים מיניים מנוחים בעלי עבה דופן) בקרקע על פסולת צמחים ועל זרעי עגבניות. Oospores נוצרים על איברים חיים של צמחים כאשר זנים מסוגים שונים של זיווג נפגשים עם לחות מוגזמת. באביב נוצר נקבוביות מינית על פקעות נגועות נטועות ועל שאריות צמחים עם או-ספורים; זואוספורות נכנסות לקרקע וגורמות לזיהום בעלים התחתונים של הצמחים. במקרים מסוימים התפטיר יכול לצמוח מהפקעת הנגועה לאורך החלק הירוק של הצמח ולרוב מופיע בחלקו העליון של הגבעול.
הבדל משמעותי בין oomycetes לרוב הפטריות נעוץ בשליטת הדיפלופזה במחזור חייהם עם מיוזה גמטית ונביטת זיגוטות (oospores) ללא ביקוע גרעיני רדוקטיבי. נראה שתכונה זו, בתוספת הטרוטאליזם דו-קוטבי המחליף דו מיניות, מאפשרות ליישם את הגישות שפותחו לחקר אוכלוסיות של אוקריוטים גבוהים יותר (ניתוח פנמיקסיה וחלוקה לאוכלוסיות, זרימת גנים תוך-אוכלוסית ובין אוכלוסייה וכו '). עם זאת, שלושה גורמים אינם מאפשרים העברת גישות אלה לחלוטין בעת לימוד אוכלוסיות P. infestans.
1. יחד עם אוספורות היברידיות, נוצרים אוכלוסיות פוריות עצמיות ופרתנוגנטיות באוכלוסיות (Fife and Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), ותדירות היווצרותם עשויה להיות מספקת להשפעה. על תוצאות הבדיקה.
2. התהליך המיני ב- P. infestans תורם תרומה לא קטנה לדינמיקה של גודל האוכלוסייה, מכיוון שהפטרייה מתרבה בעיקר על ידי נבגים צמחיים, ויוצרים יותר מ 90% מתוצאות הניתוח של סוג ההזדווגות בשיטה המסורתית על מדיום מזין. ... עונת הגידול היא מספר דורות של סיבולציה מינית (התפתחות מחלות פולי-מחזוריות). Oospores ממלאים תפקיד חשוב בשימור האורגניזם בתקופה בה אין צמחים ירוקים (בחורף) ובזיהום ראשוני של שתילים. ואז, במהלך הקיץ, מתרחשת רבייה משובטת ועלייה או להיפך, ירידה במספר השיבוטים האישיים הנובעת כתוצאה מהרקומבינציה מינית, אשר נקבעת בעיקר על ידי בחירת המתאימים יותר. לכן, היחס בין שיבוטים בודדים באוכלוסיה בתחילת וסיום האפיפיטוטיקה יכול להיות שונה לחלוטין.
3. המחזור המתואר אופייני לאוכלוסיות הילידים של P. infestans במולדתם, מרכז אמריקה. באזורים אחרים בעולם, התהליך המיני לא היה ידוע יותר ממאה שנה; התפטיר הווגטטיבי בפקעות תפוחי האדמה הנגועות היה שלב החורף. מחזור החיים היה אגמי לחלוטין, וההתפשטות הייתה מוקד באופיו: הזיהום מפקעות נטועות חד-נגועות הועבר לעלים ויצר מוקדים ראשוניים של המחלה, העלולים להתמזג עם התפתחות מסיבית של המחלה.
לפיכך, באזורים מסוימים עשויה להיות תחלופה של מחזורים מיניים וחסרי מין, ואילו באזורים אחרים - מחזור א-מיני בלבד.
מקורו של P. INFESTANS
P. infestans הופיעו באירופה בסוף המחצית הראשונה של המאה ה -1991. מכיוון שתפוח האדמה הוא יליד החלק הצפון-מזרחי של דרום אמריקה, ההנחה הייתה כי הטפיל הובא משם לאירופה בתקופת פריחתו של המלח הצ'יליאני. עם זאת, מחקרים שבוצעו בתחנת תפוחי האדמה של מרכז רוקפלר בעמק טולוקה, מקסיקו אילצו לבחון מחדש את נקודת מבט זו (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. בעמק טולוקה, למיני תפוחי אדמה פקעתיים מקומיים (Solanum demissum, S. bulbocastanum וכו ') יש קבוצות שונות של גנים להתנגדות אנכית בשילוב עם רמה גבוהה של עמידות לא ספציפית, מה שמעיד על התפתחות ארוכה של שיתוף עם הטפיל. מינים דרום אמריקאים, כולל תפוחי אדמה יבולים, חסרים גנים עמידים.
2. בעמק טולוקה, מבודדים עם סוגי הזיווג A1 ו- A2 נמצאים, וכתוצאה מכך נפוצה אוכלוסיית גזעי P. infestans; ואילו במולדת תפוחי האדמה המעובדים, בדרום אמריקה, הטפיל מתפשט באופן משובח.
3. בעמק טולוקה יש מגיפות קשות מדי שנה של דלקת מאוחרת. לכן, בקרב חוקרים צפון אמריקאים (אוניברסיטת קורנל) מתבססת הדעה על מסואמריקה (מרכז אמריקה) כמקום הולדתו של פיטופתורה תפוחי אדמה (Goodwin et al., 1994).
חוקרים דרום אמריקאים אינם שותפים לדעה זו. הם מאמינים שלתפוח האדמה המעובד והטפיל שלו P. infestans יש מולדת משותפת - האנדים הדרום אמריקאים. הם תמכו בנקודת מבטם על ידי מחקרים מולקולריים על ניתוח פולימורפיזם DNA של הגנום המיטוכונדריאלי (mtDNA) והגנים הגרעיניים RAS ו- β-tubulin (Gomez-Alpizar et al., 2007). הם הראו כי הזנים שנאספו ממקומות שונים בעולם נבעו משלושה קווי אבות שונים אשר (שלושתם) נמצאים באנדים הדרום אמריקאים. הפלוטיפים של האנדים הם צאצאים של שני קווים: מבודדים של שושלת ה- mtDNA העתיקה ביותר נמצאים על סולני-צמחיה הפראית מגזרת Anarrhicomenum באקוודור, ואילו מבודדים מהקו השני נפוצים על תפוחי אדמה, עגבניות וצלילי לילה בר. בטולוקה, אפילו הפלוטיפים נדירים נובעים משושלת אחת בלבד, כאשר השונות הגנטית של זני הטולוקה (תדירות אללית נמוכה של כמה אתרים משתנים) מעידה על אפקט מייסד חזק עקב סחיפה אחרונה.
בנוסף, נמצא באנדים מינים חדשים P. andina, הדומים מבחינה מורפולוגית וגנטית ל- P. infestans, שלדברי המחברים מצביעים על האנדים כנקודה חמה של התמצאות בסוג פיטופתורה. לבסוף, באירופה ובארצות הברית אוכלוסיות P. Infestans כוללות את שתי שושלות האנדים, בעוד שבטולוקה רק אחת.
פרסום זה עורר תגובה מקבוצת חוקרים ממדינות שונות, שעשו עבודה ניסיונית רבה כדי לשנות את המחקר שבוצע בעבר (Goss et al., 2014). בעבודה זו, ראשית, נעשה שימוש ברצפי דנ"א מיקרו-לוויים אינפורמטיביים יותר למחקר פולימורפיזם דנ"א; שנית, לניתוח אשכולות, מסלולי הגירה, הפרשי זמן של אוכלוסיות וכו '. נעשה שימוש במודלים מתקדמים יותר (סטטיסטיקה F, קירוב בייסיאני וכו '), ושלישית, נעשה שימוש בהשוואה לא רק עם המינים האנדים P. andina, בהם נקבע אופי היברידי (P. infestans x Phytophthora sp.) אך גם עם המינים האנדמיים המקסיקניים P. mirabilis, P. Ipomoeae ו- Phytophthora phaseoli, שהם קרובים גנטיים של P. infestans שנכללים באותה המצופה (Kroon et al., 2012). כתוצאה מניתוחים אלה, הוכח באופן חד-משמעי שחלק השורש של העץ הפילוגנטי של כל המינים מהסוג פיטופתורה שנלקח למחקר, למעט הכלאה P. andina, שייך לזן מקסיקני, וזרימת הנדידה מכוונת למקסיקו - אנדים, ולא להיפך, ותחילתה חופפת לאירופה. קולוניזציה של העולם החדש (לפני 300-600 שנה). לפיכך, הופעתם של מינים P. infestans, המתמחים בתבוסת תפוחי אדמה, התרחשה במרכז הגנטי המשני של היווצרות גבעולי לילה פקעת, כלומר. במרכז אמריקה.
הגנום של P. INFESTANS
בשנת 2009, צוות בינלאומי של מדענים רצף את הגנום השלם של P infestans (Haas et al, 2009), שגודלו היה 240 מגה. זה פי כמה יותר מאשר במינים קשורים זה לזה P. sojae (95 Mb), הגורמים לריקבון שורשים של פולי סויה, ו- P. Ramorum (65 Mb), המשפיעים על מיני עצים יקרי ערך כמו אלון, אשור וכמה אחרים. הנתונים שהתקבלו הראו כי הגנום מכיל מספר רב של עותקים של רצפים חוזרים - 74%. הגנום מכיל 17797 גנים מקודדי חלבון, שחלקם הגדול הם גנים המעורבים בתהליכים תאיים, כולל שכפול DNA, תעתיק ותרגום של חלבונים.
השוואה בין הגנום מהסוג Phytophthora גילתה ארגון יוצא דופן של הגנום, המורכב מגושי רצפים של גנים שמורים, בהם צפיפות הגן גבוהה יחסית, ותוכן של רצפים חוזרים ונמוך יחסית, ואזורים בודדים עם רצפי גנים שאינם משומרים, עם צפיפות גנים נמוכה ותוכן גבוה של אזורים חוזרים. חסימות שמרניות מהוות 70% (12440) מכלל הגנים המקודדים לחלבון P. infestans. בתוך בלוקים שמרניים, בדרך כלל גנים ממוקמים מקרוב עם מרחק בין-גניתי ממוצע של 604 bp. באזורים שבין בלוקים שמרניים, המרחק הבין-גני גדול יותר (3700 bp) עקב עלייה בצפיפות האלמנטים החוזרים על עצמם. גנים המופרשים במהירות של אפקטורים מתפתחים נמצאים באזורים דלים בגן.
ניתוח רצפים של הגנום P. Infestans הראה שכשליש מהגנום שייך לאלמנטים ניתנים להעברה. הגנום של P. infestans מכיל הרבה יותר משפחות של טרנספוזונים בהשוואה לגנום ידוע אחר. רוב הטרנספוזונים של P. infestans שייכים למשפחת הצוענים.
מספר רב של משפחות גנים ספציפיות המעורבות בפתוגנזה זוהו בגנום P. infestans. חלק משמעותי מהם מקודד לחלבוני אפקטור שמשנים את הפיזיולוגיה של הצמח המארח ותורמים להדבקה שלו. הם שייכים לשתי קטגוריות רחבות: אפקטורים אפופלסטיים הפועלים במרחבים הבין-תאיים (אפופלסטים) ואפקטורים ציטופלזמיים, הנכנסים לתאים דרך haustoria. אפקטורים אפופלסטיים כוללים אנזימים הידרוליטיים מופרשים כגון פרוטאזות, ליפאזות וגליקוזילאזות המשמידים תאי צמח; מעכבי אנזימי הגנה מהצומח המארח; ורעלים נמק כמו חלבונים דמויי Nep1 (NPL) וחלבונים קטנים הדומים ל- Pcf (SCR).
גנים של אפקטור P. infestans הם רבים ובדרך כלל גדולים יותר מאשר גנים שאינם פתוגניים. הידועים ביותר הם האפקטורים הציטופלזמיים RXLR ו- Crinkler (CNR). האפקטים הציטופלזמיים האופייניים של oomycetes הם חלבוני RXLR. כל גני אפקטורי ה- RXLR שהתגלו עד כה מכילים את הקבוצה הסופית האמינית Arg-XLeu-Arg, כאשר X היא חומצת אמינו. כתוצאה מהמחקר הוצע כי ישנם בגנים P. infestans 563 גנים של RXLR, שהם 60% יותר מאשר ב- P. sojae ו- P. ramorum. כמחצית מהגנים RXLR בגנום P. infestans הם ספציפיים למין. לאפקטורי RXLR יש מגוון רחב של רצפים. ביניהם זוהו אחת גדולה ו -150 משפחות קטנות. בשונה מהפרוטאום הראשי, גני אפקטורי ה- RXLR ממוקמים בדרך כלל באזורים דלים של גנים ועשירים חוזרים של הגנום. האלמנטים הניידים הקובעים את הדינמיות של אזורים אלה מקדמים רקומבינציה בגנים אלה.
אפקטים של ציטופלזמה CRN זוהו במקור בתמלילי P. infestans המקודדים פפטידים של נמק ברקמות הצמח. מאז גילוים לא היה ידוע מעט על משפחת המפעילים הללו. ניתוח הגנום של P. Infestans גילה משפחה ענקית של 196 גנים של CRN, הגדולה משמעותית מזו של P. sojae (100 CRN) ו- P. ramorum (19 CRN). בדומה ל- RXLR, CRN הם חלבונים מודולריים ומורכבים מתחום LFLAK מסוף N (50 חומצות אמינו) ומסוף DWL סמוך המכיל גנים שונים. לרוב ה- CRN (60%) יש פפטיד אות.
נחקרה האפשרות של CRN שונים לשבש את התהליכים הסלולריים של הצמח המארח. בניתוח נמק הצמחי, הסרת חלבוני CRN2 אפשרה לזהות את האזור המסוף C המורכב מ- 234 חומצות אמינו (עמדות 173-407, תחום DXG) וגורם למוות של תאים. ניתוח של P. infestans גנים של CRN גילה ארבעה אזורים שונים של C- מסוף, הגורמים גם למוות של תאים בתוך הצמח. אלה כוללים את תחומי ה- DC שזה עתה זוהו (ל- P. Infestans יש 18 גנים ו- 49 פסאודוגנים), וכן תחומים D2 (14 ו- 43) ו- DBF (2 ו- 1) הדומים לקינאזות חלבון. חלבונים מתחומי CRN המתבטאים בצמח נשמרים (בהעדר פפטיטי אות) בתא צמח וממריצים מוות של תאים על ידי מנגנון תוך-תאי. 255 רצפים נוספים המכילים תחומי CRN ככל הנראה אינם מתפקדים כגנים.
העלייה במספר ובגודל של משפחות הגן RXLR ו- CRN נבעה ככל הנראה בגלל רקומבינציה הומולוגית לא אללית ושכפול גנים. למרות העובדה שהגנום מכיל מספר רב של אלמנטים ניידים פעילים, עדיין אין עדות ישירה להעברת גנים של אפקטורים.
שיטות המשמשות לחקר מבנה האוכלוסייה
חקר המבנה הגנטי של אוכלוסיות מבוסס כיום על ניתוח תרבויות טהורות של הזנים המרכיבים אותו. ניתוח אוכלוסיות ללא בידוד יבולים טהורים מתבצע גם למטרות ספציפיות, כגון, למשל, חקר האגרסיביות של אוכלוסייה או נוכחות של זנים עמידים בפני קוטלי פטריות בה (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). סוג זה של מחקר כולל שימוש בשיטות מיוחדות, שתיאורן מעבר לתחום סקירה זו. לצורך ניתוח השוואתי של זנים משתמשים במספר שיטות המבוססות הן על ניתוח מבנה ה- DNA והן על חקר ביטויים פנוטיפיים. ניתוח השוואתי של אוכלוסיות צריך להתמודד עם מספר גדול של מבודדים, מה שמציב דרישות מסוימות לשיטות הנהוגות. באופן אידיאלי, הם צריכים לעמוד בדרישות הבאות (קוק, ליס, 2004, מולר, וולפנברגר, 1999):
- להיות זול, קל ליישום, לא דורש עלויות זמן משמעותיות, להתבסס על טכנולוגיות זמינות בדרך כלל (למשל, PCR);
- חייב לייצר מספר גדול מספיק של מאפייני סמן קודומיננטיים עצמאיים;
- בעלי שחזור גבוה;
- השתמש בכמות הרקמות המינימלית להיבדק;
- להיות ספציפי למצע (הזיהום הקיים בתרבית לא אמור להשפיע על התוצאות);
- אינם דורשים שימוש בפרוצדורות מסוכנות וכימיקלים רעילים ביותר.
למרבה הצער, אין שיטות המתאימות לכל הפרמטרים שלעיל. לצורך מחקר השוואתי על זנים בתקופתנו, נעשה שימוש בשיטות המבוססות על ניתוח תכונות פנוטיפיות: ארסיות לזני תפוחי אדמה ועגבניות (מירוצי תפוחי אדמה ועגבניות), סוג ההזדווגות, ספקטרום של איזואנזימים פפטידאזיים ואיזומראז של גלוקוז-6-פוספט, ועל ניתוח מבנה ה- DNA: פולימורפיזם אורך. קטע הגבלה (RFLP), אשר בדרך כלל מתווסף לבדיקת הכלאה RG 57, ניתוח חזרות מיקרו-לוויין (SSR ו- InterSSR), הגברה עם פריימרים אקראיים (RAPD), הגברה של שברי הגבלה (AFLP), הגברה עם פריימרים הומולוגיים לרצפי האלמנטים הניידים (למשל, Inter SINE PCR), קביעת הפלוטיפים של DNA מיטוכונדריאלי.
תיאורים קצרים של שיטות המחקר ההשוואתי על זנים המשמשים לעבודה עם פ. אינפסטאנס
תכונות סמן פנוטיפי
מירוצי "תפוחי אדמה"
מירוצי "תפוחי אדמה" הם סמן שנחקר ונמצא בשימוש נפוץ. לגזעי "תפוח אדמה פשוט" יש גן אחד לארסיות תפוחי אדמה, "מורכבים" - לפחות שניים. Black et al. (1953), בסיכום כל הנתונים העומדים לרשותם, גילו כי גזע הפיטופטורה מסוגל להדביק צמחים בגן / גנים העמידים המתאימים לגן / גנים ארסיים של P. infestans, ומצא גזעים 1, 2, 3 ו -4 המדביקים צמחים. עם הגנים R1, R2, R3 ו- R4, בהתאמה, כלומר האינטראקציה בין הטפיל למארח מתרחשת על פי עקרון הגן. יתר על כן, Black, בהשתתפות Gallegly ו- Malcolmson, גילה את גני ההתנגדות R5, R6, R7, R8, R9, R10 ו- R11, כמו גם את הגזעים המקבילים (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
ישנו מידע נרחב על הרכב הגזע של הפתוגן מאזורים שונים. מבלי לנתח נתונים אלה בפירוט, נציין רק מגמה כללית: היכן שנעשה שימוש בזנים עם גנים עמידים חדשים או בשילובים שלהם, בהתחלה הייתה היחלשות מסוימת של הדלקת המאוחרת, אך לאחר מכן הופיעו גזעים עם גנים ארסיים תואמים ונבחרו והתפרצויות של דלקת מאוחרת התחדשו. ארסיות ספציפית כנגד 4 גני ההתנגדות הראשונים (R1-R4) נצפתה לעיתים נדירות באוספים שנאספו לפני כניסתם לגידול זנים עם גנים אלה, אך מספר הזנים הארסיים גדל מאוד כאשר הפתוגן טפיל על זנים הנושאים גנים אלה. גנים 5-11, לעומת זאת, היו נפוצים למדי באוספים (שו, 1991).
מחקר על היחס בין הגזעים השונים בעונת הגידול, שבוצע בסוף שנות השמונים, הראה שבתחילת התפתחות המחלה, שיבוטים בעלי אגרסיביות נמוכה ו 1980-1 גנים ארסיים שולטים באוכלוסייה.
יתר על כן, עם התפתחות הדלקת המאוחרת, ריכוז השיבוטים המקוריים פוחת ומספר הגזעים "המורכבים" עם אגרסיביות גבוהה עולה. המופע של האחרון עד סוף העונה מגיע ל 100%. בעת אחסון פקעות ישנה ירידה בתוקפנות ובאובדן גנים ארסיים פרטניים. הדינמיקה של החלפת שיבוט יכולה להתרחש בזנים שונים בדרכים שונות (Rybakova & Dyakov, 1990). עם זאת, מחקרינו בשנים 2000-2010 הראו כי גזעים מורכבים נמצאים כבר בתחילת דרכם של אפיפיטוטיקה בקרב זנים מבודדים הן מתפוחי אדמה והן לעגבניות. הסיבה לכך היא ככל הנראה שינוי באוכלוסיות פ 'אינפסטאנים ברוסיה.
בשנים 1988-1995, המופע של "גזעי על" עם כל או כמעט כל גנים ארסיים באזורים שונים הגיע ל-70-100%. מצב זה צוין, למשל, בבלארוס, באזור לנינגרד ומוסקבה, בצפון אוסטיה ובגרמניה (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
מירוצי "עגבניות"
בזני עגבניות נמצאו רק שני גנים של עמידות בפני דלקת מאוחרת - Ph2 (Gallegly & Marvell, 1) ו- Ph1955 (Al-Kherb, 2). כמו במקרה של מירוצי תפוחי האדמה, האינטראקציה בין עגבניות ל- P. infestans מתרחשת על בסיס גן אחר גן. גזע ה- T1988 מדביק זנים שאין להם גנים עמידים (רוב הזנים המשמשים בתעשייה), גזע ה- T0 מדביק זנים בגן Ph1 (אוטווה), ובגזע T1 מדביקים זנים בגן Ph2.
ברוסיה, כמעט אך ורק T0 נמצא על תפוחי אדמה; T0 שררה על עגבניות בתחילת העונה, אך מאוחר יותר היא הוחלפה במירוץ T1 (Dyakov et al., 1975, 1994). לאחר שנת 2000, T1 על תפוחי אדמה באוכלוסיות רבות החל להתרחש ממש בתחילת האפיפיטוטיקה. בארצות הברית, זני תפוחי האדמה לא היו פתוגניים לעגבניות, כמו גם לגזעים T0, T1 ו- T2, בעוד T1 ו- T2 גברו על עגבניות (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
סוג זיווג
לצורך ביצוע המחקר נדרשים זנים בודקים (ייחוס) עם סוגי הזיווג הידועים - A1 ו- A2. מבודד הבדיקה מחוסן איתם בזוגות בכלים פטרי עם מדיום אגר שיבולת שועל. לאחר הדגירה במשך 10 ימים, נבדקות הלוחות לנוכחות או היעדר אוספורות במדיום באזור המגע של הזנים. ישנן 4 אפשרויות: הזן שייך לסוג ההזדווגות של A1, אם הוא יוצר oospores עם הבוחן A2, ל- A2, אם הוא יוצר oospores עם הבוחן A1, ל- A1A2, אם הוא יוצר oospores עם שני הבודקים, או סטרילי (00), אם הוא לא יוצר oospores ללא בודק (שתי הקבוצות האחרונות נדירות).
כדי לקבוע במהירות רבה יותר את סוגי ההזדווגות, נעשו ניסיונות לזהות אזורים בגנום הקשורים לסוג ההזדווגות, במטרה להמשיך ולהשתמש בהם כדי לקבוע את סוג ההזדווגות על ידי PCR. אחד הניסויים המוצלחים הראשונים לזיהוי אתר כזה נערך על ידי חוקרים אמריקאים (Judelson et al., 1995). בשיטת RAPD הם הצליחו לזהות את אזור ה- W16 הקשור לסוג ההזדווגות בצאצאי שני הבודדים המצטלבים, ולעצב זוג תחלונים 24-bp להגברתו (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') ו- W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') לאחר הגבלת מוצר ה- PCR עם אנזים ההגבלה HaeIII, ניתן היה להפריד מבודדים עם סוגי הזיווג A1 ו- A2.
ניסיון נוסף להשיג סמני PCR לקביעת סוגי ההזדווגות בוצע על ידי חוקרים קוריאנים (Kim, Lee, 2002). הם זיהו מוצרים ספציפיים בשיטת AFLP. כתוצאה מכך פותחו זוג פריימרים PHYB-1 (קדימה) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') ו- PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), המאפשרים הגברה סלקטיבית של אזור הגנום המשויך לסוג ההזדווגות A2. בהמשך, הם המשיכו בעבודה זו ועיצבו תחלונים 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, קדימה) ו- 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), מה שמאפשר הגברה סלקטיבית של אזור Mat-A1, המאפיין זנים עם סוג הזדווגות. A1. השימוש באבחון PCR מסוגי הזדווגות הראה תוצאות טובות במחקר על אוכלוסיות P. infestans בצ'כיה (Mazakova et al., 2006), תוניסיה (Jmour, Hamada, 2006) ואזורים אחרים. במעבדה שלנו (Mytsa, Elansky, טרם פורסם), נותחו 34 P. infestans זנים מבודדים מאברי תפוחי אדמה ועגבניות חולים באזורים שונים ברוסיה (Kostroma, Ryazan, Astrakhan, and Moscow). תוצאות ניתוח ה- PCR תוך שימוש בפריימרים ספציפיים ביותר מ 90% חפפו את תוצאות הניתוח של סוג ההזדווגות בשיטה המסורתית על מדיום מזין.
טבלה 1. שונות ההתנגדות בתוך שיבוט Sib 1 (Elansky et al., 2001)
מיקום איסוף לדוגמא | מספר המבודדים שנותח | מספר זנים רגישים (S), עמידים חלשים (SR) ועמידים (R), יח '(%) | ||
S | SR | R | ||
ג 'ולדיווסטוק | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
ג'י צ'יטה | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
אירקוצק | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
ג 'קרסנויארסק | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
עיר יקטרינבורג | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
או סחלין | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
אזור אומסק | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
עמידות למטאקסיל כסמן אוכלוסין
בתחילת שנות השמונים נצפו באזורים שונים התפרצויות חזקות של דלקת מאוחרת שנגרמה על ידי זני P. infestans עמידים למטאקסיל. חוות תפוחי אדמה במדינות רבות סבלו מהפסדים משמעותיים (Dowley & O'Sullivan, 1980; Davidse et al., 1981; Derevyagina, 1983). מאז, במדינות רבות בעולם, נערך ניטור מתמיד אחר הופעתם של זנים עמידים בפני פנילאמיד באוכלוסיות P. infestans. בנוסף להערכה מעשית של סיכויי השימוש בתרופות המכילות פנילמיד, בניית מערכת של אמצעי הגנה וניבוי אפיפיטוטים, עמידות לתרופות אלה הפכה לאחד ממאפייני הסמן המשמשים באופן נרחב לניתוח השוואתי של אוכלוסיות של פתוגן זה. עם זאת, השימוש בהתנגדות למטאקסיל במחקרי אוכלוסיה השוואתיים צריך להתבצע תוך התחשבות בעובדה ש: 1991 - הבסיס הגנטי של ההתנגדות טרם נקבע במדויק, 1 - עמידות למתכתקסיל היא תכונה תלויה סלקטיבית שיכולה להשתנות בהתאם לשימוש בפנילמיד, 2 - שונות. מידת הרגישות לזני metalaxyl בקו משובט אחד (טבלה 3).
ספקטרום של איזוזימים
סמני האיזוזים בדרך כלל אינם תלויים בתנאים חיצוניים, מראים תורשה מנדלית והם קודומנטיים, ומאפשרים להבחין בין הומו-הטרוזיגוטים. השימוש בחלבונים כסמנים גנים מאפשר לזהות הן ארגון מחדש גדול של החומר הגנטי, כולל מוטציות כרומוזומליות וגנומיות, והן תחליפי חומצות אמינו בודדות.
מחקרים אלקטרופורטיים של חלבונים הראו שרוב האנזימים קיימים באורגניזמים בצורה של כמה שברים הנבדלים בתנועתיות אלקטרופורטית. שברים אלה הם תוצאה של קידוד של צורות מרובות של אנזימים על ידי לוקוסים שונים (איזוזימים או איזוזימים) או על ידי אללים שונים של אותו לוקוס (אלוזימים או אלואנזימים). כלומר, איזוזימים הם צורות שונות של אנזים אחד. צורות שונות בעלות אותה פעילות קטליטית, אך שונות במקצת בתחליפי חומצות אמינו בודדות בפפטיד ובאחריות. הבדלים כאלה מתגלים במהלך אלקטרופורזה.
במחקר של זני P. infestans משתמשים בספקטרום של איזואנזימים של שני חלבונים, פפטידאז ואיזומרז של גלוקוז 6-פוספט (אנזים זה מונומורפי באוכלוסיות רוסיות, לכן שיטות המחקר שלו אינן מוצגות בעבודה זו). כדי להפריד אותם לאיזוזימים בשדה חשמלי, תכשירי חלבון המבודדים מהאורגניזמים שנחקרו מוחלים על צלחת ג'ל המונחת בשדה חשמלי. קצב הדיפוזיה של חלבונים בודדים בג'ל תלוי במטען ובמשקל המולקולרי; לכן, בשדה חשמלי, תערובת החלבונים מופרדת לשברים נפרדים, אותם ניתן לדמיין באמצעות צבעים מיוחדים.
המחקר של איזואנזימים של פפטידאז מתבצע על ג'לים של תאית אצטט, עמילן או פוליאקרילאמיד. הנוחה ביותר היא השיטה המבוססת על שימוש בג'ל תאית אצטט המיוצרים על ידי הלנה מעבדות בע"מ. זה לא דורש כמויות גדולות של חומרי בדיקה, הוא מאפשר להשיג רצועות מנוגדות על הג'ל לאחר אלקטרופורזה עבור שני לוקוסים האנזים, יישומו אינו דורש זמן רב ועלויות חומר (איור 2).
פיסת תפטיר קטנה מועברת למיקרו-צינור של 1,5 מ"ל, ומוסיפים לה 1-2 טיפות מים מזוקקים. לאחר מכן, המדגם הוא הומוגני (למשל, עם מקדחה חשמלית עם חיבור פלסטיק המתאים לצינור מיקרו) ומשקעים במשך 25 שניות בצנטריפוגה ב 13000 סל"ד. 8 μl מכל מיקרו-צינור. supernatant מועבר לצלחת המוליך.
ג'ל אצטט תאית מוסר ממיכל החיץ, מוחק בין שני גיליונות נייר סינון ומונח עם שכבת העבודה על גבי בסיס הפלסטיק של המוליך. התמיסה מהצלחת מועברת על ידי המוליך על הג'ל 2-4 פעמים. הג'ל מועבר לחדר אלקטרופורזה,
טבלה 2. הרכב התמיסה המשמש לצביעת ג'ל אצטט תאית בניתוח של איזואנזימים פפטידאזיים, טיפת צבע (כחול ברומופנול) מונחת על קצה הג'ל.
TRIS HCl, 0,05M, Ph 8,0 2 מ"ל
פרוקסידאז, 1000 U / ml 5 טיפות
o-dianisidine, 4 מ"ג / מ"ל 8 טיפות
MgCl2, 20 מ"ג / מ"ל 2 טיפות
גלי-ליו, 15 מ"ג / מ"ל 10 טיפות
L- חומצה אמינית אוקסידאז, 20 u / ml 2 טיפות
אלקטרופורזה מתבצעת במשך 20 דקות. ב 200 V. לאחר אלקטרופורזה, הג'ל מועבר לשולחן ציור ומוכתם בתמיסת ציור מיוחדת (טבלה 2). 10 מ"ל אגר DIFCO 1,6% נמס באופן ראשוני בתנור מיקרוגל, מקורר ל 60 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מערבבים 2 מ"ל אגר עם תערובת צבע ויוצקים על ג'ל. פסים מופיעים תוך 15-20 דקות. מגיב L- חומצה אמינו אוקסידאז מתווסף ממש לפני ערבוב התמיסה עם אגר מותך.
באוכלוסיות רוסיות, לוקוס Pep 1 מיוצג על ידי גנוטיפים 100/100 ו- 92/100. הומוזיגוטה 92/92 היא נדירה ביותר (כ 0,1%). לוקוס רהר 2 מיוצג על ידי שלושה גנוטיפים 100/100, 100/112 ו- 112/112, וכל שלוש הגרסאות נפוצות למדי (אלנקי וסמירנוב, 3, איור 2003).
מחקר גנום
פולימורפיזם באורך שבר הגבלה עם הכלאה שלאחר מכן (RFLP-RG 57)
ה- DNA הכולל מטופל באנזים הגבלה Eco R1, שברי DNA מופרדים באמצעות אלקטרופורזה בג'ל agarose. ה- DNA הגרעיני הוא גדול מאוד ויש לו רצפים חוזרים רבים, מה שמקשה על ניתוח ישיר של השברים הרבים המתקבלים על ידי פעולת אנזימי הגבלה. לכן, שברי ה- DNA המופרדים בג'ל מועברים לקרום מיוחד ומשמשים להכלאה עם החללית RG 57, הכוללת נוקלאוטידים המסומנים בתוויות רדיואקטיביות או פלואורסצנטיות. בדיקה זו מכליאה עם רצפי גנום חוזרים ונשנים (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). לאחר הדמיה של תוצאות הכלאה על חומר קליל או רדיואקטיבי, מתקבל פרופיל הכלאה רב-לוקוס (טביעת אצבע) המיוצג על ידי 25-29 שברים (Forbes et al., 1998). צאצאים מיניים (משובטים) יהיו בעלי אותם פרופילים. על פי סידור הלהקות על האלקטרופורוגרמה, הדמיון והשוני של האורגניזמים בהשוואה נשפטים.
הפלוטיפים של DNA מיטוכונדריאלי
ברוב התאים האאוקריוטים, mtDNA מוצג בצורה של מולקולת DNA מעגלית דו-גדילית, שבניגוד לכרומוזומי הגרעין של תאים אוקריוטים, היא משכפלת באופן שמרני למחצה ואינה קשורה למולקולות חלבון.
רצף הגנום המיטוכונדריאלי של P. infestans, ומספר עבודות הוקדשו לניתוח אורכי קטעי הגבלה (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). לאחר שגריפית 'ושו (1998) פיתחו שיטה פשוטה ומהירה לקביעת הפלוטיפים של mtDNA, סמן זה הפך לאחד הפופולריים ביותר במחקרי P. Infestans. מהות השיטה מורכבת מהגברה רציפה של שני שברי DNA מיטוכונדריאליים (מהגנום המשותף) עם פריימרים F2-R2 ו- F4-R4 (טבלה 3) והגבלתם לאחר מכן עם אנזימי הגבלה MspI (שבר 1) ו- EcoR1 (שבר שני). השיטה מאפשרת לך לזהות 2 הפלוטיפים: Ia, IIa, Ib, IIb. סוג II שונה מסוג I על ידי נוכחות של תוספת בגודל 4 bp ועל ידי מיקום אחר של אתרי הגבלה באזורים P1881 ו- P2 (איור 4).
מאז 1996, בין הזנים שנאספו בשטח רוסיה, נצפו רק הפלוטיפים Ia ו- IIa (Elansky et al., 2001, 2015). ניתן לזהות אותם לאחר הפרדת מוצרי ההגבלה עם פריימר F2-R2 בשדה חשמלי (איור 4, 5). סוגים של mtDNA משמשים לניתוח השוואתי של זנים ואוכלוסיות. במספר עבודות שימשו סוגים של DNA מיטוכונדריאלי לבידוד קווים משובטים ולדרכון מבודדי P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). בשיטת PCR-RFLP, הגיעו למסקנה ש- mtDNA הוא הטרוגני באותו זן P. infestans (Elansky and Milyutina, 2007). תנאי הגברה: פי 1 (500 שניות 94 מעלות צלזיוס), פי 40 (30 שניות 90 מעלות צלזיוס, 30 שניות 52 מעלות צלזיוס, 90 שניות 72 מעלות צלזיוס); 1x (5 דקות. 72 מעלות צלזיוס). תערובת תגובה: (20 μl): 0,2 U פולימראז DNA טאק, 1x 2,5 מ"מ מאגר MgCl2-Taq, 0,2 מ"מ כל dNTP, פריימר 30 pM ו- 5 ng של ה- DNA שנותח, מים ללא יונים - עד 20 μl.
הגבלת המוצר PCR מתבצעת במשך 4-6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תערובת הגבלה (20 μl): 10x MspI (2 μl), חיץ הגבלה 10x (2 μl), מים ללא יונים (6 μl), מוצר PCR (10 μl).
טבלה 3. פריימרים המשמשים להגברה של אזורים פולימורפיים mtDNA
לוקוס | פריימר | אורך פריימר ומיקום | אורך מוצר PCR | הגבלה |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
הגברת פריימר אקראית (RAPD)
בעת ביצוע RAPD נעשה שימוש בפריימר אחד (לפעמים מספר פריימרים בו זמנית) עם רצף נוקלאוטיד שרירותי, בדרך כלל 10 נוקלאוטידים, עם תוכן גבוה (מ- 50%) נוקלאוטידים GC וטמפרטורת חישול נמוכה (כ- 35 מעלות צלזיוס). פריימרים כאלה "נוחתים" באתרים משלימים רבים בגנום. לאחר הגברה מתקבל מספר גדול של אמפיקונים. מספרם תלוי בפריימר (ים) המשמשים ובתנאי התגובה (ריכוז MgCl2 וטמפרטורת חישול).
ויזואליזציה של amplicons מתבצעת על ידי זיקוק polyacrylamide או ג'ל agarose. בעת ביצוע ניתוח RAPD, יש צורך לעקוב בקפידה אחר טוהר החומר הניתוח, מכיוון ש זיהום בחפצים חיים אחרים עלול לגרום לעלייה משמעותית במספר החפצים, שהם רבים למדי בניתוח החומר הטהור (Perez et al, 1998). השימוש בשיטה זו במחקר הגנום P. infestans בא לידי ביטוי בעבודות רבות (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). הבחירה בתנאי התגובה והפריימרים (נחקרו 51 פריימרים של 10 נוקליאוטידים) ניתנים במאמר מאת אבו-אל סאמן ואח ', (2003).
ניתוח חזרה על מיקרו-לווין (SSR)
חזרות מיקרו-לוויניות (חזרות רצף פשוטות, SSR) הן חוזרות במקביל על רצפים קצרים של 1-3 (לפעמים עד 6) נוקליאוטידים הקיימים בגנום הגרעיני של כל האיקריוטים. מספר החזרות הרציפות יכול לנוע בין 10 ל 100. לוקוסים מיקרו-לווייניים מתרחשים בתדירות גבוהה למדי ומפוזרים פחות או יותר באופן שווה בכל הגנום (Lagercrantz et al., 1993). פולימורפיזם של רצפי מיקרו-לווין קשור להבדלים במספר החזרות של המוטיב הבסיסי. סמני מיקרו-לוויין הם קודומיננטיים, מה שמאפשר להשתמש בהם לניתוח מבנה האוכלוסייה, קביעת קרבה, נתיבי הגירה של גנוטיפים וכו '. בין יתרונותיהם האחרים של סמנים אלה, יש לשים לב לפולימורפיזם הגבוה שלהם, לשחזור טוב, לנייטרליות וליכולת לבצע ניתוח והערכה אוטומטיים. ניתוח פולימורפיזם של חזרות מיקרו-לווין מתבצע על ידי הגברה של PCR באמצעות פריימרים המשלימים לרצפים ייחודיים המאגדים את המיקרו-לווין. בתחילה, הניתוח בוצע עם הפרדת מוצרי התגובה על ג'ל פוליאקרילאמיד. מאוחר יותר, עובדי חברת Applied Biosystems הציעו להשתמש בפריימרים עם תווית פלואורסצנטית עם זיהוי מוצרי תגובה באמצעות גלאי לייזר אוטומטי (Diehl et al., 1990), ואז רצפי DNA אוטומטיים סטנדרטיים (Ziegle et al., 1992). תיוג של תחל עם צבעי פלורסנט שונים מאפשר לנתח מספר סמנים בבת אחת על נתיב אחד ובהתאם לכך להגדיל באופן משמעותי את תפוקת השיטה ולהגדיל את דיוק הניתוח.
הפרסומים הראשונים שהוקדשו לשימוש בניתוח SSR לחקר P. infestans הופיעו בתחילת שנות האלפיים. (קנאפובה, גיסי, 2000). לא כל הסמנים שהציעו המחברים הראו מידה מספקת של פולימורפיזם, עם זאת, שניים מהם (2002B ו- G4) נכללו בערכה של 11 סמני SSR שהוצעו על ידי Lees et al. (12) ואומצו לאחר מכן על ידי רשת המחקר Eucablight (www.eucablight). .org) כסטנדרט עבור P. infestans. כמה שנים מאוחר יותר התפרסם מחקר על יצירת מערכת לניתוח מולטיפלקס של ה- DNA של P. infestans המבוסס על שמונה סמני SSR (Li et al., 2006). לבסוף, לאחר הערכת כל הסמנים שהוצעו בעבר ובחירת האינפורמטיבי ביותר מביניהם, כמו גם אופטימיזציה של תחל, תוויות פלואורסצנטיות ותנאי הגברה, אותה קבוצת מחברים הציגה מערכת לניתוח רב-תכליתי של שלב אחד, כולל 2010 סמנים (טבלה 12; Li et al. , 4 א). הפריימרים המשמשים במערכת זו נבחרו ותויגו באחד מארבעה סמני פלורסנט (FAM, VIC, NED, PET) כך שטווחי גדלי האללים של פריימרים עם אותם תוויות לא חופפים.
הכותבים ביצעו את הניתוח על מגבר PTC200 (MJ Research, ארה"ב) באמצעות ערכות PCR של QIAGEN מולטיפלקס או ערכות PCR של מיקרו לוואי QIAGEN Typeit. נפח תערובת התגובה היה 12.5 μL. תנאי ההגברה היו כדלקמן: עבור QIAGEN מולטיפלקס PCR: 95 מעלות צלזיוס (15 דקות), 30x (95 מעלות צלזיוס (20 שניות), 58 מעלות צלזיוס (90 שניות), 72 מעלות צלזיוס (60 שניות), 72 מעלות צלזיוס (20 דקות); עבור QIAGEN Type-it מיקרו לוואי PCR: 95 ° C (5 דקות), 28x (95 ° C (30 שניות), 58 ° C (90 שניות), 72 ° C (20 שניות), 60 ° C (30 דקות)
הפרדה והדמיה של מוצרי PCR בוצעו באמצעות מנתח DNA נימי אוטומטי ABI3730 (Applied Biosystems).
טבלה 4. מאפיינים של 12 סמני SSR סטנדרטיים המשמשים לגנוטיפ של P. Infestans (Li et al., 2013a)
שם | מספר האללים | טווח גודל אללים (bp) | פריימרים |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACAACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
דוגמה להדמיה של תוצאות הניתוח מוצגת באיור. 6. התוצאות נותחו באמצעות תוכנת GeneMapper 3.7 על ידי השוואת הנתונים שהתקבלו עם הנתונים של בידודים ידועים. כדי להקל על הפרשנות של תוצאות הניתוח, יש צורך לכלול 1-2 מבודדי התייחסות עם גנוטיפ ידוע בכל מחקר.
שיטת המחקר המוצעת נבדקה על מספר לא מבוטל של דגימות שדה, ולאחריה המחברים סטנדרטיים פרוטוקולים בין מעבדות של שני ארגונים, מכון ג'יימס האטון (בריטניה) ואוניברסיטת ווגינגן ומחקר (הולנד), אשר יחד עם האפשרות להשתמש בכרטיסי FTA סטנדרטיים לפשטים איסוף ומשלוח של דגימות DNA של P. infestans, אפשרו לנו לדבר על האפשרות לשימוש מסחרי בפיתוח זה. בנוסף, שיטה מהירה ומדויקת של גנוטיפ של מבודדים של P. infestans באמצעות ניתוח SSR מולטיפלקס אפשרה לערוך מחקרים סטנדרטיים של אוכלוסיות של מחולל מחלות זה בקנה מידה עולמי, ויצירת מאגר עולמי בנושא דלקת מאוחרת במסגרת פרויקט Eucablight (www.eucablight.org), כולל , כולל תוצאות ניתוח המיקרו-לווין, אפשרו לעקוב אחר הופעתם והתפשטותם של גנוטיפים חדשים ברחבי העולם.
פולימורפיזם אורך קטע הגבלה מוגבר (AFLP). AFLP (פולימורפיזם באורך שבר מוגבר) היא טכנולוגיה ליצירת סמנים מולקולריים אקראיים באמצעות פריימרים ספציפיים. ב- AFLP, מטפלים ב- DNA בשילוב של שני אנזימי הגבלה. מתאמים ספציפיים קשורים לקצוות הדביקים של שברי ההגבלה.
שברים אלה מוגברים לאחר מכן באמצעות פריימרים המשלימים את רצף המתאם ואתר ההגבלה, ונושאים בנוסף בסיס אחד או יותר אקראי בקצות 3 'שלהם. מערך השברים המתקבל תלוי באנזימי הגבלה ובנוקליאוטידים שנבחרו באופן אקראי בקצות 3'של הפריימרים (Vos et al., 1995). AFLP - גנוטיפ משמש לחקר מהיר של השונות הגנטית של אורגניזמים שונים.
תיאור מפורט של השיטה ניתן בעבודותיהם של מולר, וולפנברגר, 1999, Savelkoul et al., 1999. עבודה רבה בהשוואת הרזולוציה של שיטות AFLP ו- SSR בוצעה על ידי חוקרים סינים. נבדקו המאפיינים הפנוטיפיים והגנוטיפיים של 48 בידוד P. infestans שנאספו מחמישה אזורים בצפון סין. הספקטרום של ה- AFLP גילה שמונה גנוטיפים שונים של DNA, בניגוד לגנוטיפים של ה- SSR, שלא נמצא גיוון עבורם (Guo et al., 2008).
הגברה עם פריימרים הומולוגיים לרצפי האלמנטים הניידים
סמנים שמקורם ברצפים של רטרוטרנספוזונים נוחים מאוד למיפוי גנטי, לחקר המגוון הגנטי ותהליכים אבולוציוניים (שולמן, 2006). אם פריימרים מיוצרים כדי להשלים את הרצפים היציבים של אלמנטים ניידים מסוימים, ניתן להגביר את אזורי הגנום הנמצאים ביניהם. במחקרים על הגורם הסיבתי של הדלקת המאוחרת, יושמה בהצלחה השיטה להגברת חלקי הגנום באמצעות פריימר משלים לרצף הליבה של ה- SINE (אלמנטים גרעיניים קצרים משולבים) (לברובה ואלנסקי, 2003). בשיטה זו התגלו הבדלים גם אצל צאצאים לא-מיניים של מבודד אחד. בהקשר זה, הגיעו למסקנה כי שיטת ה- inter-SINE-PCR היא מאוד ספציפית וקצב התנועה של אלמנטים SINE בגנום Phytophthora הוא גבוה.
בגנום P. infestans זוהו 12 משפחות של רטרטרנספוזונים קצרים (SINE); נבדקה התפלגות המינים של רטרוטרנספוזונים קצרים ונחשפו אלמנטים (SINE) שנמצאים בגנום של P. infestans בלבד (Lavrova, 2004).
תכונות של יישום שיטות מחקר השוואתי של זנים במחקרי אוכלוסייה
בעת תכנון לימוד, יש צורך להבין היטב את המטרות שאליהן היא שואפת ולהשתמש בשיטות המתאימות. לפיכך, שיטות מסוימות מאפשרות ליצור מספר רב של סימני סמן עצמאיים, אך יחד עם זאת יש להן שכפול נמוך ותלות מאוד בתגובות המשמשות, בתנאי התגובה ובזיהום של החומר הנחקר. לכן, בכל מחקר של קבוצת זנים, יש צורך להשתמש בכמה מבודדים סטנדרטיים (הפניות), אך גם במקרה זה, קשה מאוד לשלב את התוצאות של מספר ניסויים.
קבוצת שיטות זו כוללת RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. לאחר ההגברה מתקבל מספר רב של שברי DNA בגדלים שונים. רצוי להשתמש בטכניקות כאלה כאשר יש צורך לבסס הבדלים בין זנים קרובים זה לזה (צאצאי הורים, מוטציות מסוג בר וכו '), או במקרים בהם נדרש ניתוח מפורט של מדגם קטן. לפיכך, שיטת AFLP נמצאת בשימוש נרחב במיפוי גנטי של P. infestans (van der Lee et al., 1997) ובמחקרים על אוכלוסייה (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). שיטות כאלה אינן מעשיות לשימוש בעת יצירת מאגרי מידע של זנים, שכן זה כמעט בלתי אפשרי לאחד את חשבונאות התוצאות בעת ביצוע ניתוחים במעבדות שונות.
למרות הפשטות והמהירות לכאורה של הביצוע (בידוד DNA ללא טיהור טוב, הגברה, הדמיה של התוצאות), קבוצת שיטות זו מחייבת שימוש בשיטה מיוחדת לתיעוד התוצאות: זיקוק בג'ל פוליאקרילאמיד עם פריימרים שכותרתו (רדיואקטיביים או מאירים) וחשיפה לאחר מכן לאור או לחומר רדיואקטיבי. הדמיית ג'ל אגרוזיס אתידיום ברומיד קונבנציונלית בדרך כלל אינה מתאימה לשיטות אלה משום מספר רב של שברי DNA בגדלים שונים יכול להתמזג.
שיטות אחרות, להיפך, מאפשרות ליצור מספר קטן של תכונות עם ההעתקות הגבוהה ביותר שלהן. קבוצה זו כוללת את המחקר של הפלוטיפים של ה- DNA המיטוכונדריאלי (ברוסיה נצפו רק שני הפלוטיפים Ia ו- IIa), סוג ההזדווגות (רוב הבודדים מחולקים לשני סוגים: A2 ו- A1, לעתים רחוקות SF פוריות עצמית) ונמצא ספקטרום של פפטידאז איזוזים (שני לוקוסים Pep2 ו- Pep1. , המורכב משני איזוזימים כל אחד) ואיזומראז של גלוקוז 2-פוספט (ברוסיה אין תכונה זו שונות, אם כי נצפה פולימורפיזם משמעותי במדינות אחרות בעולם). רצוי להשתמש בתכונות אלה בעת ניתוח אוספים, קומפילציה של מאגרי מידע אזוריים ועולמיים. במקרה של ניתוח איזוזימים והפלוטיפים של DNA מיטוכונדריאלי, ניתן להסתדר בכלל ללא זנים סטנדרטיים, ואילו בניתוח סוגי ההזדווגות נדרשים שני מבודדי בדיקה עם סוגי זיווג ידועים.
תנאי התגובה והריאגנטים יכולים להשפיע רק על הניגודיות של המוצר על גבי האלקטרופורוגרמה; ביטוי החפצים בסוגי מחקרים אלה אינו סביר.
נכון לעכשיו, רוב האוכלוסיות בחלק האירופי של רוסיה מיוצגות על ידי זנים של שני סוגי ההזדווגות (טבלה 6), ביניהן ישנם מבודדים עם סוגי Ia ו- IIa של DNA מיטוכונדריאלי (סוגים אחרים של mtDNA שנמצאו בעולם לא נמצאו ברוסיה לאחר 1993). הספקטרום של איזואימי פפטידז מיוצג על ידי שני גנוטיפים במיקום Pep1 (100/100, 92/92 והטרוזיגוטה 92/100, וגנוטיפ 92/92 הוא נדיר ביותר (<0,3%)) ועל ידי שני גנוטיפים במיקום Pep 2 (100/100 , 112/112 והטרוזיגוטה 100/112, כאשר הגנוטיפ 112/112 מופיע בתדירות נמוכה יותר מ 100/100, אך גם לעיתים קרובות למדי).
לא הייתה שונות בספקטרום האיזואנזימים של איזומרז גלוקוז-6-פוספט לאחר 1993 (היעלמות הקו המשובט US-1); לכל הבודדים שנחקרו היה גנוטיפ 100/100 (אלנסקי וסמירנוב, 2002).
הקבוצה השלישית של שיטות מאפשרת להשיג קבוצה מספקת של תכונות סמן עצמאיות עם שחזור גבוה. כיום, קבוצה זו כוללת את החללית RFLP-RG57, המייצרת 25-29 שברי DNA בגדלים שונים. ניתן להשתמש ב- RFLP-RG57 הן בניתוח דוגמאות והן בהרכבת מאגרי מידע. עם זאת, שיטה זו יקרה בהרבה מהקודמות, היא גוזלת זמן ודורשת כמות גדולה מספיק של DNA מטוהר מאוד. לכן, החוקר נאלץ להגביל את נפח החומר שנבדק.
התפתחות ה- RFLP-RG57 בראשית שנות ה -90 של המאה הקודמת העצימה משמעותית את מחקרי האוכלוסייה של הגורם הסיבתי של הדלקת המאוחרת. זה הפך לבסיס השיטה המבוססת על בחירה וניתוח של "קווים משובטים" (ראה להלן). יחד עם RFLP-RG57, סוג הזדווגות, טביעת אצבעות DNA (שיטת RFLP-RG57), ספקטרום של פפטידאז ואיזואנזים איזומרז גלוקוז-6-פוספט, וסוג DNA מיטוכונדריאלי משמשים לזיהוי קווים משובטים. בזכותו הוא הוצג כבר ב- 1994, החלפת אוכלוסיות ישנות באוכלוסיות חדשות (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), חשף קווים משובטים שרווחו במדינות רבות בעולם. מחקרים על זנים רוסיים בשיטה זו הראו פולימורפיזם גנוטיפי גבוה של זני החלק האירופי ומונומורפיזם של אוכלוסיות אזורי אסיה והמזרח הרחוק של רוסיה (Elansky et al, 2001). ועכשיו שיטה זו נשארת העיקרית במחקרי אוכלוסייה של P. infestans. עם זאת, תפוצתו הרחבה מונעת בגלל העלות הגבוהה למדי ועוצמת העבודה שלה בביצוע.
טכניקה מבטיחה נוספת המשמשת לעיתים רחוקות במחקרי P. infestans היא ניתוח חזרה על מיקרו-לוויין (SSR). נכון לעכשיו, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לבידוד קווים משובטים. לצורך ניתוח הזנים, נעשה שימוש נרחב בתכונות סמן פנוטיפיות כמו נוכחות גנים ארסיים לזני תפוחי אדמה (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) ועגבניות (וממשיכות בשימוש). נכון לעכשיו, גנים עבור ארסיות לזנים של תפוחי אדמה איבדו את ערכם כתכונות סמן למחקרי אוכלוסייה בשל הופעת המספר המרבי (או קרוב אליו) של גני ארסיות ברוב המכריע של המבודדים. יחד עם זאת, גן הארסיות T1 עבור זני עגבניות הנושאים את הגן Ph1 המקביל עדיין משמש בהצלחה כתכונת סמן (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
בעבודות רבות, עמידות בפני קוטלי פטריות משמשת כתכונת סמן. תכונה זו אינה רצויה לשימוש במחקרי אוכלוסייה בשל הופעתם הקלה למדי של מוטציות עמידות בקווים משובטים לאחר מריחת קוטלי פטריות המכילים metalaxyl- (או mefenoxam-) בשטח. לדוגמא, הבדלים משמעותיים ברמת ההתנגדות הוצגו בקו המשובט של Sib1 (Elansky et al., 2001).
לפיכך, סוג ההזדווגות, ספקטרום האיזוזים של פפטידאז, סוג ה- DNA המיטוכונדריאלי, RFLP-RG57, SSR הם סמנים מועדפים ליצירת בנקי נתונים ולתיוג זנים באוספים. כדי להשוות דגימות מוגבלות, אם יש צורך להשתמש במספר המרבי של תכונות הסמן, אתה יכול להשתמש ב- AFLP, RAPD, InterSSR, PCR בין סינים (טבלה 5). עם זאת, יש לזכור כי שיטות אלה אינן ניתנות לשחזור, ובכל ניסוי פרטני (מחזור אלקטרופורזה הגברה), יש להשתמש בכמה מבודדי התייחסות.
טבלה 5. השוואה בין שיטות מחקר שונות של זנים פ. אינפסטאנים
קרִיטֶרִיוֹן | TC | שוטרי איזופר | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | לְהַאִיץ |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
כמות המידע | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
שחזור | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
אפשרות לחפצים | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
עלות | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
עוצמת העבודה | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
מהירות ניתוח ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
הערה: H - נמוך, C - בינוני, B - גבוה; НС * - עוצמת העבודה נמוכה בשימוש בג'ל agarose או אוטומטי
גנוטיפר, בינוני - על ידי זיקוק בג'ל פוליאקרילאמיד עם פריימרים שכותרתו,
** - לא סופרים את הזמן המושקע בגידול התפטיר לבידוד DNA.
מבנה אוכלוסייה
קווים משובטים
בהעדר רקומבינציה או תרומתה הלא משמעותית למבנה האוכלוסייה, האוכלוסייה מורכבת ממספר מסוים של שיבוטים, שהחלפות גנטיות ביניהן נדירות ביותר.
באוכלוסיות כאלה, אינפורמטיבי יותר לחקור לא את התדרים של גנים בודדים, אלא את התדרים של גנוטיפים שמקורם משותף (קווים משובטים או שושלות משובטים) ושונים רק במוטציות נקודתיות. מחקרי אוכלוסייה של פתוגן הדלקת המאוחרת וניתוח קווים משובטים האיצו משמעותית מאז הופעתה של שיטת RFLP-RG57 בראשית שנות ה -90 של המאה הקודמת. יחד עם RFLP-RG57, סוג ההזדווגות, הספקטרום של פפטידאז ואיזואנזים איזומרז של גלוקוז-6-פוספט, וסוג DNA מיטוכונדריאלי משמשים לזיהוי קווים משובטים. המאפיינים של הקווים המשובטים הנפוצים ביותר מוצגים בטבלה 6.
שיבוט ארה"ב -1 שלט באוכלוסיות בכל מקום עד סוף שנות השמונים, ולאחר מכן הוא החל להיות מוחלף על ידי שיבוטים אחרים ונעלם מאירופה וצפון אמריקה. הוא נמצא כיום במזרח הרחוק (פיליפינים, טייוואן, סין, יפן, קוריאה, קו ואח ', 80, Mosa et al, 1994), באפריקה (אוגנדה, קניה, רואנדה, Goodwin et al, 1993, Vega-Sanchez et. al., 1994; Ochwo et al., 2000) ובדרום אמריקה (אקוודור, ברזיל, פרו, Forbes et al., 2002, Goodwin et al., 1997). באוסטרליה בלבד לא זוהו זנים השייכים לקו US-1994. ככל הנראה, מבודדים של P. infestans הגיעו לאוסטרליה עם גל הגירה נוסף (Goodwin, 1).
שיבוט ארה"ב 6 נדד מצפון מקסיקו לקליפורניה בסוף שנות השבעים וגרם למגיפה בתפוחי אדמה ועגבניות לאחר 70 שנים ללא מחלות. בשל האגרסיביות הגבוהה שלה, היא עקרה את השיבוט האמריקני 32 והחלה לשלוט בחוף המערבי של ארצות הברית (Goodwin et al., 1a).
הגנוטיפים US-7 ו- US-8 התגלו בארצות הברית בשנת 1992, וכבר בשנת 1994 הופצו באופן נרחב בארצות הברית ובקנדה. במהלך עונת שדה אחת, שיבוט US-8 מסוגל לעקור כמעט לחלוטין את שיבוט US-1 בחלקות תפוחי אדמה שנדבקו בתחילה בשני השיבוטים בריכוז שווה (מילר וג'ונסון, 2000).
שיבוטים BC-1 עד BC-4 זוהו בקולומביה הבריטית במספר קטן של מבודדים מ- Goodwin et al., 1995b). שיבוט ארה"ב 11 התפשט באופן נרחב בארצות הברית והחליף את ארה"ב -1 בטייוואן. שיבוטים JP-1 ו- EC-1, יחד עם שיבוט US-1, נפוצים ביפן ובאקוודור, בהתאמה (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 הוא שיבוט ששרר ברוסיה על שטח עצום מאזור מוסקבה ועד סחלין. באזור מוסקבה הוא התגלה בשנת 1993, ואוכלוסיות שדה מסוימות כללו בעיקר זנים של קו משובט זה, עמידים מאוד למתכת-אקסיל. לאחר 1993, שכיחותו של שיבוט זה פחתה משמעותית. מחוץ לאוראל בשנים 1997-1998, SIB-1 נמצא בכל מקום, למעט טריטוריה של Khabarovsk (השיבוט SIB-2 נפוץ שם). ההפרדה המרחבית של שיבוטים עם סוגים שונים של זיווג אינה כוללת את התהליך המיני בסיביר ובמזרח הרחוק. באזור מוסקבה, בניגוד לסיביר, האוכלוסייה מיוצגת על ידי שיבוטים רבים; כמעט לכל מבודד יש גנוטיפ ייחודי למולטי-פוקוס (Elansky et al., 2001, 2015). אי אפשר להסביר את המגוון הזה רק על ידי ייבוא של זני פטרייה מאזורים שונים בעולם עם חומר זרעים מיובא. מכיוון ששני סוגי ההזדווגות מתרחשים באוכלוסייה, יתכן שהמגוון שלה נובע גם משילוב מחדש. לפיכך, בקולומביה הבריטית, ההנחה של הופעת גנוטיפים BC-2, BC-3 ו- BC-4 נובעת מהכלאה של שיבוטים BC-1 ו- US-6 (Goodwin et al., 1995b). יתכן כי זנים היברידיים נמצאים באוכלוסיות מוסקבה. לדוגמא, זנים MO-4, MO-8 ו- MO-11 הטרוזיגוטים עבור מוקד PEP יכולים להיות היברידיות בין זנים MO-12, MO-21, MO-22, בעלי סוג הזיווג A2 והומוזיגוטיים עבור אלל אחד של מוקד PEP והזן. MO-8, בעל סוג ההזדווגות A1 והומוזיגוטי לאלל אחר של הלוקוס. ואם זה המקרה, ובאוכלוסיות מודרניות של P. infestans יש נטייה לעלייה בתפקיד התהליך המיני, אז ערך המידע של ניתוח שיבוטים מולטי-פוקוס יפחת (Elansky et al., 2001, 2015).
וריאציה בקווים משובטים
עד שנות ה -90 של המאה העשרים, קו המשובט US-20 היה נפוץ בעולם. מרבית אוכלוסיות השדה והאזורים היו מורכבות אך ורק מזנים עם הגנוטיפ US-1. עם זאת, נצפו גם הבדלים בין מבודדים, ככל הנראה נגרמים על ידי תהליך מוטציה. מוטציות התרחשו גם ב- DNA גרעיני וגם במיטוכונדריה והשפיעו בין היתר על רמת העמידות לתרופות פנילמיד ומספר הגנים הארסיים. קווים השונים מהגנוטיפים המקוריים על ידי מוטציות מסומנים על ידי מספרים נוספים לאחר הנקודה העוקבת אחר שם הגנוטיפ המקורי (למשל, קו המוטציה US-1 של קו המשובט US-1.1). קווי DNA עם טביעות אצבעות US-1 ו- US-1.5 מכילים קווים אביזרים בגדלים שונים (Goodwin et al., 1.6a, 1995b); הקו המשובט US-1995 שונה גם מ- US-6.3 לפי קו אביזרים אחד (Goodwin, 6, לוח 1997).
במחקר ה- DNA המיטוכונדריאלי נמצא שרק ה- DNA המיטוכונדריאלי מסוג 1 נמצא בקו המשובט US-1 (Carter et al., 1990). עם זאת, במחקר של זנים של שושלת משובטים זו מפרו והפיליפינים, נמצאו מבודדים שסוגי ה- DNA המיטוכונדריה שלהם נבדלים מ- 1b בנוכחות הכנסות ומחיקות (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
טבלה 6. גנוטיפים מרובי-מיקוד של כמה קווים משובטים של P. infestans
שם | סוג זיווג | איזוזימים | טביעות אצבע DNA | סוג MtDNA | |
GPI | זריזות | ||||
ארה"ב 1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 + 24 | Ib |
ארה"ב 2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
ארה"ב 3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 + 24 | - |
ארה"ב 4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 + 24 | - |
ארה"ב 5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
ארה"ב 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 + 24 | IIb |
ארה"ב 7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
ארה"ב 8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
ארה"ב 9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
ארה"ב 10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
ארה"ב 11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIb |
ארה"ב 12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | - |
ארה"ב 14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 + 24 | - |
ארה"ב 15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
ארה"ב 16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 + 24 | - |
ארה"ב 17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 + 24 | - |
ארה"ב 18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
ארה"ב 19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
הערה: * - ללא נתונים.
טבלה 7. גנוטיפים מרובי-מיקוד וקווי המוטציה שלהם
שם | סוג זיווג | | טביעות אצבעות DNA (RG57) | הערות | |
GPI | PEP-1 | ||||
ארה"ב 1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | גנוטיפ מקורי 1 |
ארה"ב 1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | מוטציה ב- PEP |
ארה"ב 1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | מוטציה ב- RG57 |
ארה"ב 1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | מוטציה ב- RG57 |
ארה"ב 1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | מוטציה ב- RG57 וב- PEP |
ארה"ב 1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | מוטציה ב- RG57 |
ארה"ב 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | גנוטיפ מקורי 2 |
ארה"ב 6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | מוטציה ב- PEP |
ארה"ב 6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | מוטציה ב- RG57 |
ארה"ב 6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | מוטציה ב- RG57 |
ארה"ב 6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | מוטציה ב- RG57 וב- PEP |
ארה"ב 6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | מוטציה ב- RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | גנוטיפ מקורי 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | מוטציה ב- RG57 |
ישנם גם שינויים בספקטרום של איזוזימים. ככלל, הם נגרמים על ידי התמוטטות של אורגניזם ההטרוזיגוטי בתחילה לאנזים זה לאנשי הומוזיגוטים. בשנת 1993, על פירות עגבניות, זיהינו זן בעל מאפיינים המאפיינים US-1: טביעת אצבעות RG57, סוג DNA מיטוכונדריאלי וגנוטיפ 86/100 עבור גלוקוז-6-פוספטי-איזומרז, אך הוא היה הומוזיגוט (100/100) עבור המיקום הראשון של הפפטידאז במקום הטרוזיגוטה 92/100 האופיינית לקו המשובט הזה. קראנו לגנוטיפ של זן זה MO-17 (טבלה 6). קווי המוטציה US-1.1 ו- US-1.4 שונים גם מ- US-1 על ידי מוטציות במיקום הפפטידאז הראשון (טבלה 7).
מוטציות המובילות לשינויים במספר גני הארסיות עבור זני תפוחי אדמה ועגבניות שכיחות למדי. הם נצפו בקרב מבודדי הקו המשובט US-1 באוכלוסיות מהולנד (Drenth et al., 1994), פרו (Goodwin et al., 1995a), פולין (Sujkowski et al., 1991), צפון אמריקה הצפונית (Goodwin et al., ., 1995 ב). הבדלים במספר הגנים של ארסיות תפוחי אדמה נצפו גם בקרב מבודדי הקווים המשובטים US-7 ו- US-8 בקנדה ובארצות הברית (Goodwin et al., 1995a), בקרב מבודדי קו SIB-1 בחלק האסייתי של רוסיה (Elansky et al, 2001 ).
מבודדים עם הבדלים חזקים ברמות העמידות לתרופות פנילמיד זוהו באוכלוסיות שדה חד-שבטיות, שכולן שייכות לקו המשובט Sib-1 (Elansky et al, 2001, טבלה 1). כמעט כל הזנים של הקו המשובט US-1 רגישים מאוד למטאקסיל. עם זאת, מבודדים עמידים מאוד של קו זה בודדו בפיליפינים (Koh et al., 1994) ובאירלנד (Goodwin et al., 1996).
אוכלוסיות מודרניות של P. infestans
מרכז אמריקה (מקסיקו)
אוכלוסיית P. infestans במקסיקו נבדלת במידה ניכרת מאוכלוסיות עולם אחרות, בעיקר בגלל מיקומה ההיסטורי. מחקרים רבים על אוכלוסייה זו ומיני P. infestans קשורים של פיטופתורה, כמו גם מינים מקומיים מהסוג סולנום, הובילו למסקנה שהתפתחות הפתוגן בחלק המרכזי של מקסיקו התרחשה יחד עם התפתחותם של צמחים מארחים וקשורה לרקומבינציה מינית (Grünwald, Flier. , 2005). שני סוגי ההזדווגות מיוצגים באוכלוסייה, ובפרופורציות שוות, והימצאותם של אוספורות באדמה, על צמחים ופקעות של תפוחי אדמה ומינים הקשורים לגידול בר Solanum מאשר את קיומו של תהליך מיני באוכלוסייה (Fernández-Pavía et al., 2002). מחקרים אחרונים על עמק טולוקה וסביבתה (מרכז המוצא המשוער של הפתוגן) אישרו את המגוון הגנטי הגבוה של האוכלוסייה המקומית של P. infestans (134 גנוטיפים רב-מיקודיים במדגם של 176 דגימות) ואת נוכחותם של כמה תת-אוכלוסיות מובחנות באזור (Wang et al., 2017). גורמים התורמים לבידול זה הם החלוקה המרחבית של אוכלוסיות משנה האופייניות לאזור הרמות של מרכז מקסיקו, הבדלים בתנאי העיבוד ובזני תפוחי האדמה המשמשים בעמקים ובהרים, והימצאותם של מיני סולאנום פקעת בר שיכולים לשמש כמארחים אלטרנטיביים (Fry et al. ., 2009).
עם זאת, יש לציין כי אוכלוסיות P. infestans בצפון מקסיקו משובחות יותר באופיין ודומות יותר לאוכלוסיות בצפון אמריקה, מה שעשוי להצביע על כך שהם הגנוטיפים החדשים (Fry et al., 2009).
Северная Америка
לאוכלוסיות צפון אמריקאיות של P. infestans תמיד היה מבנה פשוט מאוד והאופי המשובט שלהם נקבע הרבה לפני השימוש בניתוח מיקרו-לווין. עד 1987, קו המשובט US-1 שלט בארצות הברית ובקנדה (Goodwin et al., 1995). באמצע שנות ה -70, כאשר הופיעו קוטלי פטריות על בסיס מטאקסיל, החל שיבוט זה הוחלף בגנוטיפים אחרים ועמידים יותר שנדדו ממקסיקו (Goodwin et al., 1998). בסוף שנות ה -90. הגנוטיפ US-8 החליף לחלוטין את הגנוטיפ US-1 בארצות הברית והפך לקו המשובטים הדומיננטי בתפוחי אדמה (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). המצב היה שונה עם עגבניות, שהכילו כל הזמן כמה קווים משובטים, והרכבן השתנה משנה לשנה (Fry et al., 2009).
בשנת 2009 פרצה בארצות הברית מגיפה רחבת היקף של דלקת מאוחרת על עגבניות. מאפיין של מגפה זו היה הופעתה כמעט בו זמנית במקומות רבים בצפון מזרח ארצות הברית, והתברר כי היא קשורה למכירות אדירות של שתילי עגבניות נגועות במרכזי גינה גדולים (Fry et al., 2013). הפסדי היבול היו עצומים. ניתוח מיקרו-לווין של הדגימות המושפעות העלה כי זן הפנדמיה שייך לסוג ההזדווגות המשובט US-22 A2. בשנת 2009, חלקו של גנוטיפ זה באוכלוסייה האמריקאית של P. infestans הגיע ל -80% (Fry et al., 2013). בשנים שלאחר מכן, שיעור הגנוטיפים האגרסיביים US-23 (בעיקר על עגבניות) ו- US-24 (על תפוחי אדמה) גדל בהתמדה באוכלוסייה, אולם לאחר 2011, שיעור הגילוי של US-24 ירד משמעותית, ועד היום כ- 90% מאוכלוסיית הפתוגנים ב ארצות הברית מיוצגת על ידי הגנוטיפ US-23 (Fry et al., 2015).
בקנדה, כמו בארצות הברית, בסוף שנות ה -90. הגנוטיפ הדומיננטי US-1 הוחלף על ידי US-8, שמעמדו הדומיננטי נותר ללא שינוי עד 2008. בשנים 2009-2010. בקנדה היו מגיפות דלקת מאוחרות קשות הקשורות למכירת שתילי עגבניות נגועות, אך הן נגרמו על ידי הגנוטיפים US-23 ו- US-8 (Kalischuk et al., 2012). ההבדל הגיאוגרפי הברור של גנוטיפים אלה היה מדהים: ארה"ב -23 שלטה במחוזות המערביים של קנדה (68%), ואילו ארה"ב -8 שלטה במחוזות המזרחיים (83%). בשנים שלאחר מכן התפשטה ארה"ב 23 לאזורים המזרחיים. עם זאת, באופן כללי, חלקה באוכלוסייה פחת מעט על רקע הופעתם של גנוטיפים ארה"ב -22 וארה"ב -24 במדינה (Peters et al., 2014). נכון להיום, US-23 שומרת על מעמד דומיננטי ברחבי קנדה; US-8 קיים בקולומביה הבריטית, בעוד US-23 ו- US-24 נמצאים באונטריו (Peters, 2017).
לפיכך, אוכלוסיות צפון אמריקה של P. infestans הן בעיקר קווים משובטים. במהלך 40 השנים האחרונות, מספר הגנוטיפים המשובטים שזוהו הגיע ל 24. למרות העובדה כי זנים של שני סוגי ההזדווגות נמצאים באוכלוסיה, הסבירות להופעת גנוטיפים חדשים כתוצאה של רקומבינציה מינית נותרה נמוכה למדי. עם זאת, בעשרים השנים האחרונות נרשמו כמה מקרים של הופעת אוכלוסיות רקומביננטיות ארעיות (Gavino et al., 20; Danies et al., 2000; Peters et al., 2014), ובמקרה אחד, תוצאת המעבר הייתה הגנוטיפ US-2014 , שהיה מושרש בצפון אמריקה במשך שנים רבות (Gavino et al., 11). עד שנת 2000, שינויים במבנה האוכלוסיות נקשרו להופעתם של גנוטיפים חדשים ותוקפניים יותר עם הגירתם ותזוזתם של קודמים דומיננטיים בעבר. מה קרה בשנים 2009-2009 בארה"ב ובקנדה, חומרים אפיפיטוטיים לראשונה הראו שבעידן הגלובליזציה, התפרצויות של המחלה יכולות להיות קשורות להתפשטות פעילה של גנוטיפים חדשים בעת מכירת חומר שתילה נגוע.
דרום אמריקה
עד לאחרונה, מחקרים על אוכלוסיות דרום-אמריקה של P. infestans לא היו רגילים ולא בקנה מידה גדול. ידוע שמבנה האוכלוסיות הללו הוא די פשוט וכולל 1-5 שושלות משובטות למדינה (Forbes et al., 1998). אז עד שנת 1998, הגנוטיפים US-1 (ברזיל, צ'ילה) BR-1 (ברזיל, בוליביה, אורוגוואי, פרגוואי), EC-1 (אקוודור, קולומביה, פרו וונצואלה), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 ו- AR-5 (ארגנטינה), PE-3 ו- PE-7 (דרום פרו). הזיווג מסוג A2 היה קיים בברזיל, בוליביה וארגנטינה ולא נמצא מעבר לגבול בוליביה-פרואני באזור אגם טיטיקקה, שמאחוריו שלט הגנוטיפ EC-1 A1 באנדים. בעגבניות, US-1 נותר בגנוטיפ הדומיננטי בכל דרום אמריקה.
המצב נמשך פחות או יותר בשנות האלפיים. נקודה חשובה הייתה גילוי קו משובט חדש EC-2000 מסוג A2 על קרובי בר של תפוחי אדמה (S. brevifolium ו- S. tetrapetalum) בצפון האנדים (Oliva et al., 2). מחקרים פילוגנטיים הראו כי קו זה אינו זהה לחלוטין ל- P. infestans, למרות שהוא קשור אליו באופן הדוק, בהקשר זה הוצע לשקול אותו, כמו גם קו נוסף, EC-2010, מבודד מעץ העגבניות S. betaceum הגדל באנדים, זן חדש בשם פ 'אנדינה; עם זאת, מעמדו של מין זה (זן עצמאי או הכלאה של P. infestans עם קו שעדיין לא ידוע) עדיין לא ברור (Delgado et al., 3).
נכון לעכשיו, כל האוכלוסיות בדרום אמריקה של P. infestans משובטות. למרות נוכחותם של שני סוגי ההזדווגות, לא זוהו אוכלוסיות רקומביננטיות. בעגבניות הגנוטיפ האמריקני 1 נמצא בכל מקום, כנראה נעקר מתפוחי אדמה על ידי זנים מקומיים, שמקורם המדויק עדיין אינו ידוע. בברזיל, בוליביה ואורוגוואי, הגנוטיפ BR-1 קיים; בפרו, יחד עם US-1 ו- EC-1, ישנם כמה גנוטיפים מקומיים אחרים. באנדים, העמדה הדומיננטית נשמרת על ידי הקו המשובט EC-1, שמערכת היחסים שלו עם פ 'ואנדינה שהתגלתה לאחרונה נותרה עלומה. המקום ה"לא יציב "היחיד בו לתקופה 2003-2013. היו שינויים משמעותיים באוכלוסייה, הפכו לצ'ילה (Acuña et al., 2012), שם בשנים 2004-2005. אוכלוסיית הפתוגן התאפיינה בהתנגדות למטאקסיל ובפלוטיפ DNA מיטוכונדריאלי חדש (Ia במקום ה- Ib שנמצא בעבר). 2006 עד 2011 באוכלוסייה שלט גנוטיפ 21 (על פי SSR) שחלקו הגיע ל 90%, לאחר מכן כף היד עברה לגנוטיפ 20, שתדירות הופעתו בשנתיים הקרובות נשמרה על כ 67% (Acuña, 2015).
אירופה
בהיסטוריה של אירופה, היו לפחות שני גלי הגירה של P. infestans מצפון אמריקה: במאה ה -1. (HERB-1) וראשית המאה ה -70 (US-1). ההתפלגות הנמצאת בכל מקום של קוטלי פטריות המכילים metalaxyl בשנות ה -XNUMX. הוביל לתזוזה של הגנוטיפ הדומיננטי US-XNUMX והחלפתו בגנוטיפים חדשים. כתוצאה מכך, ברוב מדינות מערב אירופה אוכלוסיות הפתוגן יוצגו בעיקר על ידי כמה קווים משובטים.
השימוש בניתוח מיקרו-לוויני לניתוח אוכלוסיות פתוגן איפשר לחשוף שינויים חמורים שהתרחשו במערב אירופה בשנים 2005-2008. בשנת 2005 התגלה בבריטניה קו משובט חדש שנקרא 13_A2 (או "כחול 13") ומאופיין בסוג ההזדווגות A2. , אגרסיביות גבוהה ועמידות בפני פנילמיד (Shaw et al., 2007). אותו גנוטיפ נמצא בדגימות שנאספו בשנת 2004 בהולנד ובצפון צרפת, מה שהציע שהוא נודד לבריטניה מיבשת אירופה, אולי עם תפוחי אדמה זרעים (Cooke et al., 2007). המחקר על הגנום של נציגי קו משובט זה הראה מידה גבוהה של פולימורפיזם של הרצף שלו (עד שנת 2016, מספר הווריאציות התת-משובטיות שלו הגיע ל -340) ומידה משמעותית של שונות ברמת הביטוי הגנטי, כולל. גנים של אפקטורים במהלך זיהום בצמח (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). מאפיינים אלה, יחד עם משך הזמן המוגבר של השלב הביוטרופי, עלולים לגרום לאגרסיביות מוגברת של 13_A2 ויכולתו להדביק אפילו זני תפוחי אדמה העמידים בפני דלקת מאוחרת.
בשנים הבאות התפשט הגנוטיפ במהירות ברחבי מדינות צפון מערב אירופה (בריטניה, אירלנד, צרפת, בלגיה, הולנד, גרמניה) עם העקירה בו זמנית של הגנוטיפים הדומיננטיים בעבר 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; ואן דן בוש ואח ', 2011; קוק, 2015; קוק, 2017). על פי האתר www.euroblight.net, חלקה של 13_A2 באוכלוסיות של מדינות אלה הגיע ל-60-80% ויותר; נוכחותו של גנוטיפ זה תועדה גם בחלק ממדינות מזרח ודרום אירופה. עם זאת, בשנים 2009-2012. 13_A2 איבדה את מעמדותיה הדומיננטיות בבריטניה ובצרפת, נכנעה לקו 6_A1 (8_A1 באירלנד), ובהולנד ובבלגיה הוחלף חלקית בגנוטיפים 1_A1, 6_A1 ו- 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
עד כה, כ- 70% מאוכלוסיית P. infestans במערב אירופה היא חד שבטית. על פי האתר www.euroblight.net, הגנוטיפים הדומיננטיים במדינות צפון מערב אירופה (בריטניה, צרפת,
הולנד, בלגיה) נשארות, בערך בפרופורציות שוות, 13_A2 ו- 6_A1, והאחרונה כמעט ולא מתרחשת מחוץ לאזור שצוין (למעט אירלנד), אך כבר יש לה לפחות 58 תת-מחזורים (Cooke, 2017). וריאציות 13_A2 קיימות במספרים ניכרים בגרמניה, והן נצפות באופן ספורדי במדינות מרכז ודרום אירופה. גנוטיפ 1_A1 מהווה חלק משמעותי מאוכלוסיות בלגיה ובחלקן הולנד וצרפת. גנוטיפ 8_A1 התייצב באוכלוסיית אירופה ברמה של 3-6%, למעט אירלנד, שם היא שומרת על מעמדה המוביל ומחולקת לשתי תת-שיבוטים (Stellingwerf, 2017). לבסוף, בשנת 2016, חלה עלייה בתדירות ההופעה של גנוטיפים חדשים 36_A2 ו- 37_A2, שנרשמה לראשונה בשנים 2013-2014; עד כה, גנוטיפים אלה נמצאים בהולנד ובבלגיה ובחלקם בצרפת ובגרמניה, כמו גם בחלקה הדרומי של בריטניה (Cooke, 2017). כ 20-30% מאוכלוסיית מערב אירופה מיוצגת על ידי גנוטיפים ייחודיים מדי שנה.
שלא כמו מערב אירופה, עד שהגנוטיפ 13_A2 הופיע, אוכלוסיות צפון אירופה (שבדיה, נורבגיה, דנמרק, פינלנד) לא היו מיוצגות על ידי קווים משובטים, אלא על ידי מספר רב של גנוטיפים ייחודיים (Brurberg et al.,
2011). בתקופת ההתפשטות הפעילה של 13_A2 במערב אירופה, נוכחותו של גנוטיפ זה בסקנדינביה לא נצפתה עד שנת 2011, אז התגלה לראשונה בצפון יוטלנד (דנמרק), שם מגדלים בעיקר זני תפוחי אדמה תעשייתיים תוך שימוש פעיל במכיל מתכת-אקסיל. קוטלי פטריות (Nielsen et al., 2014). על פי www.euroblight.net, גנוטיפ 13_A2 התגלה גם בכמה דגימות מנורבגיה ודנמרק בשנת 2014 ובכמה דגימות נורבגיות בשנת 2016; בנוסף, בשנת 2013 צוינה בפינלנד נוכחותו של גנוטיפ 6_A1 בכמות קטנה. הסיבה העיקרית לכישלונם של 13_A2 וקווים משובטים אחרים בכיבוש סקנדינביה נחשבת להבדלי האקלים באזור זה ממדינות מערב אירופה.
בנוסף לעובדה שקיץ קריר וחורפים קרים תורמים להישרדותם של תפטיר צמחוני לא גדול כמו oospores (Sjöholm et al., 2013), הקפאת אדמה בחורף (שבדרך כלל אינה מתרחשת במדינות חמות יותר במערב אירופה) תורמת לסינכרון של נביטה ונטיעה של oospores. תפוח אדמה, המשפר את תפקידם כמקור לזיהום ראשוני (Brurberg et al., 2011). כמו כן יש לציין כי בתנאים הצפוניים התפתחות הזיהום מ- oospores עולה על התפתחות זיהום פקעת, מה שבסופו של דבר מונע שליטה של קווים משובטים אף יותר, אך מאוחר יותר התפתחו (Yuen, 2012). מבנה האוכלוסיות הנחקרות ביותר של P. infestans במזרח אירופה (פולין, המדינות הבלטיות) דומה מאוד לזה שבסקנדינביה.
שני סוגי ההזדווגות נמצאים גם כאן, והרוב המכריע של הגנוטיפים שנקבעו על ידי ניתוח ה- SSR הם ייחודיים (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). כמו בצפון אירופה, התפלגות הקווים המשובטים (בעיקר של הגנוטיפ 13_A2) כמעט ולא השפיעה על האוכלוסיות המקומיות של הפתוגן, השומרות על רמה גבוהה של גיוון בהיעדר קווים דומיננטיים מובהקים.
נוכחותם של 13_A2 נצפתה מדי פעם בשדות עם זני תפוחי אדמה מסחריים. ברוסיה המצב מתפתח בצורה דומה. ניתוח מיקרו-לווין של מבודדי P. infestans שנאספו בשנים 2008-2011 בעשרה אזורים שונים בחלק האירופי של רוסיה, הראו רמה גבוהה של מגוון גנוטיפי וחוסר צירופי מקרים מוחלטים עם קווים משובטים אירופיים (Statsyuk et al., 10). מספר שנים מאוחר יותר, מחקר שנערך על דגימות P. infestans שנאספו באזור לנינגרד בשנים 2014-2013 הראה הבדלים משמעותיים בינם לבין הגנוטיפים מאזור זה שזוהו במחקר הקודם. בשני המחקרים לא נמצאו גנוטיפים מערב אירופיים (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2014).
המגוון הגנטי הגבוה של אוכלוסיות P. infestans במזרח אירופה והיעדר קווים משובטים דומיננטיים בהם עשויים להיות קשורים לכמה סיבות. ראשית, כמו בצפון אירופה, תנאי האקלים של המדינות הנחשבות תורמים ליצירת אוספורות כמקור זיהום ראשוני (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). שנית, חלק ניכר מתפוחי האדמה המיוצרים במדינות אלה גדלים בחוות פרטיות קטנות, לעתים קרובות מוקפות ביערות או מכשולים אחרים לתנועה חופשית של חומר זיהומי (Chmielarz et al., 2014). ככלל, תפוחי אדמה שגדלים בתנאים כאלה אינם מטופלים כמעט בכימיקלים, ובחירת הזנים מבוססת על עמידותם בפני הדלקת המאוחרת, כלומר. אין לחץ סלקטיבי לתוקפנות ולעמידות בפני מתכת-אקסיל, השולל גנוטיפים עמידים, כגון 13_A2, יתרונות על פני גנוטיפים אחרים (Chmielarz et al., 2014). לבסוף, בשל גודלם הקטן של מגרשים, בעליהם בדרך כלל אינם מתרגלים לסיבוב יבול, ומגדלים תפוחי אדמה באותו מקום במשך שנים, דבר התורם להצטברות של חיסון מגוון גנטית (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
אסיה
עד לאחרונה, מבנה אוכלוסיות P. infestans באסיה נותר מובן יחסית. היה ידוע שהוא מיוצג בעיקר על ידי קווים משובטים, וההשפעה של רקומבינציה מינית על הופעתם של גנוטיפים חדשים היא קטנה מאוד. כך, למשל, בשנים 1997-1998. בחלק האסייתי של רוסיה (סיביר והמזרח הרחוק), אוכלוסיית הפתוגן יוצגה על ידי שלושה גנוטיפים בלבד עם דומיננטיות של גנוטיפ SIB-1 (Elansky et al., 2001). נוכחותם של קווי פתוגן משובטים הוכחה במדינות כמו סין, יפן, קוריאה, הפיליפינים וטייוואן (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). הקו המשובט US-1 שלט על שטח גדול של אסיה בסוף שנות ה -90 - תחילת שנות האלפיים. כמעט בכל מקום החלו להחליף גנוטיפים אחרים, שבתורם פינו את מקומם לחדשים. ברוב המקרים, שינויים במבנה ובהרכב האוכלוסיות במדינות אסיה היו קשורים לנדידת גנוטיפים חדשים מבחוץ. לפיכך, ביפן, למעט גנוטיפ JP-2000, לכל שאר הגנוטיפים היפניים שהופיעו לאחר US-3 (JP-1, JP-1, JP-2) מקור חיצוני מוכח פחות או יותר (Akino et al., 3) ... יש כיום שלוש אוכלוסיות פתוגנים עיקריות בסין, עם חלוקה גיאוגרפית ברורה; אין זרימת גנים או חלשה מאוד בין אוכלוסיות אלה (Guo et al., 2011; Li et al., 2010b). גנוטיפ 2013_A13 הופיע בשטחה של סין במחוזותיה הדרומיים (יונאן וסצ'ואן) בשנים 2-2005 ובשנים 2007-2012. נראה גם בצפון מזרח המדינה (Li et al., 1014b). בהודו 2013_A13 הופיע ככל הנראה באותו זמן כמו בסין, ככל הנראה עם תפוחי אדמה נגועים (Chowdappa et al., 2), ובשנים 2015-2009. גרם לאפיפיטוזיס רציני של הדלקת מאוחרת בעגבניה בדרום המדינה, שלאחריה התפשט לתפוחי אדמה ובשנת 2010 גרם להתפרצות של דלקת מאוחרת במערב בנגל, מה שהוביל להרס והתאבדות של חקלאים מקומיים רבים (Fry, 2014).
אפריקה
עד 2008-2010 מחקרים שיטתיים של P. infestans במדינות אפריקה לא בוצעו. כרגע ניתן לחלק את האוכלוסיות האפריקאיות של P. infestans לשתי קבוצות, וחלוקה זו קשורה בבירור לעובדה של יבוא של תפוחי אדמה זרעים מאירופה.
בצפון אפריקה, המייבאת פעיל תפוחי אדמה מזרע מאירופה, סוג ההזדווגות של A2 מיוצג באופן נרחב כמעט בכל האזורים, מה שמספק אפשרות תיאורטית להופעתם של גנוטיפים חדשים כתוצאה מהקומבינציה המינית (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). בנוסף, באלג'יריה מציינים את נוכחותם של הגנוטיפים 13_A2, 2_A1 ו- 23_A1 עם דומיננטיות בולטת של הראשון מהם, כמו גם ירידה הדרגתית בשיעור הגנוטיפים הייחודיים עד להיעלמות מוחלטת (Rekad et al., 2017). בניגוד לשאר האזור, בתוניסיה (למעט צפון מזרח המדינה), אוכלוסיית הפתוגן מיוצגת בעיקר על ידי סוג ההזדווגות A1 (Harbaoui et al., 2014).
הקו המשובט NA-01 דומיננטי כאן. באופן כללי, שיעור הקווים המשובטים באוכלוסייה הוא 43% בלבד. במזרח ודרום אפריקה, שם היקף יבוא הזרעים הוא מעט נעלם (Fry et al., 2009), P. infestans מיוצג על ידי שני קווים משובטים בלבד מסוג A1, US-1 ו- KE-1, והאחרון מעקף את הראשון באופן פעיל על תפוחי אדמה ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). עד כה, לשני הגנוטיפים הללו יש מספר ניכר של וריאציות משנה.
אוסטרליה
הדיווח הראשון על הדלקת מאוחרת על תפוחי אדמה באוסטרליה הוא משנת 1907, ואפיפיטוטיה הראשונה, ככל הנראה שנגרמה על ידי גשמים עזים בחודשי הקיץ, התרחשה בשנים 1909-1911. (Drenth et al., 2002). אולם באופן כללי, לדלקת מאוחרת אין משמעות כלכלית משמעותית עבור המדינה. התפרצויות ספרדיות של דלקת מאוחרת, המתעוררת על ידי תנאי מזג האוויר המספקים לחות גבוהה, מתרחשות לא פעם ב 5-7 שנים וממוקמות בעיקר בצפון טסמניה ובמרכז ויקטוריה. בקשר לאמור לעיל, פרסומים המוקדשים לחקר מבנה האוכלוסייה האוסטרלית של P. infestans נעדרים כמעט. המידע העדכני ביותר זמין בין השנים 1998-2000. (Drenth et al., 2002). לדברי המחברים, אוכלוסיית ויקטוריה הייתה קו משובט US-1.3, אשר אישר בעקיפין את נדידתו של גנוטיפ זה מארצות הברית. הדגימות הטסמניות סווגו כ- AU-3, שונות מהגנוטיפים שהיו באותה תקופה באזורים אחרים בעולם.
מאפייני התפתחות הדלקת המאוחרת ברוסיה
באירופה, זיהום שהוכנס עם פקעות זרעים חולות, אוספורות שהתנוססו באדמה, כמו גם זואוספורנגיה שהובאה על ידי הרוח מצמחים שגדלו מפקעות חורפות בשדות אשתקד (צמחים "מתנדבים"), או על ערימות של צמחים שהושלכו, נחשבים לחיסון העיקרי בתפוחי האדמה. סימניה לאחסון פקעות. מתוכם, צמחים הגדלים בערימות של פקעות זרוקות נחשבים למקור ההדבקה המסוכן ביותר. שם, מספר הפקעות המונבטות הוא לעתים קרובות משמעותי, וניתן לשאת מתוכם zoosporangia למרחקים ארוכים. שאר המקורות (oospores, צמחים "מתנדבים") אינם מסוכנים כל כך, כי לא נהוג לגדל צמחים באותם שדות לעתים קרובות יותר מפעם ב 3-4 שנים. זיהום מפקעות זרעים חולות הוא גם מינימלי בגלל מערכת בקרת איכות זרעים טובה.
באופן כללי, כמות הבידוד באוכלוסיות אירופאיות מוגבלת, ולכן הגידול במגיפה איטי למדי וניתן לשלוט בה בהצלחה באמצעות תכשירים קוטלי פטריות כימיים. המשימה העיקרית בתנאים האירופיים היא המאבק בזיהום בשלב שבו מתחילה פיזור המוני של zoosporangia מצמחים מושפעים.
ברוסיה המצב שונה בתכלית. רוב יבול תפוחי האדמה והעגבניות גדל בגנים פרטיים קטנים; אמצעי הגנה או לא מבוצעים עליהם כלל, או שטיפולי קוטלי פטריות מתבצעים במספר לא מספיק ומתחילים לאחר הופעת הדלקת המאוחרת בחלק העליון. כתוצאה מכך, גני ירק פרטיים משמשים כמקור הזיהום העיקרי, שממנו נושאת הרוח זואוספורנגיה לנטיעות מסחריות. זה אושר על ידי התצפיות הישירות שלנו במוסקבה, בריאנסק, קוסטרומה, אזורי ריאזאן: נזק לצמחים בגנים פרטיים נצפה עוד לפני תחילת טיפולי קוטלי פטריות של נטיעות מסחריות. בהמשך, המגיפה בשדות גדולים מרוסנת על ידי שימוש בתכשירים קוטלי פטריות, ואילו בגנים פרטיים יש התפתחות מהירה של דלקת מאוחרת.
במקרה של טיפולים לא תקינים או "תקציביים" של נטיעות מסחריות, מוקדי דלקת מאוחרת מופיעים גם בשדות; בהמשך הם מתפתחים באופן פעיל ומכסים שטחים גדולים יותר ויותר (אלנסקי, 2015). לזיהום בגנים פרטיים יש השפעה משמעותית על מגיפות בתחומי מסחר. בכל אזורי גידול תפוחי האדמה ברוסיה, השטח שתופס תפוחי אדמה בגנים פרטיים גדול פי כמה מהשטח הכולל של שדות של יצרנים גדולים. בסביבה כזו ניתן לראות בגינות ירק פרטיות כמשאב חיסון עולמי לשדות מסחריים. בואו ננסה לזהות את המאפיינים האופייניים לגנוטיפים של זנים בגנים פרטיים.
שתילת פיקוח על זרעי תפוחי אדמה ללא זרעים והסגר, זרעי עגבניות המתקבלים מיצרנים זרים מפוקפקים, גידול ארוך טווח של תפוחי אדמה ועגבניות באותם אזורים, טיפולים לא תקינים בקוטלי פטריות או היעדרם המוחלט מובילים לאפיפיטוטים חמורים במגזר הפרטי, שהתוצאה שלהם היא בחינם מעבר, הכלאה והיווצרות אוסבוסים בגנים פרטיים. כתוצאה מכך נצפה במגוון גנוטיפי גבוה מאוד של הפתוגן, כאשר כמעט כל זן הוא ייחודי בגנוטיפ שלו (Elansky et al., 2001, 2015). שתילת תפוחי אדמה מזרע ממוצא גנטי שונה אינה סבירה שיופיעו קווים משובטים המתמחים לתקוף זן מסוים. הזנים שנבחרו במקרה כזה נבדלים על ידי צדדיותם ביחס לזנים המושפעים, לרובם יש מספר מקסימלי של גנים ארסיים. זה שונה מאוד ממערכת ה"קווים המשובטים "האופיינית לשדות גדולים של ארגונים חקלאיים עם מערכת מותקנת כראוי של הגנה מפני דלקת מאוחרת. "קווים משובטים" (כאשר כל הזנים של פתוגן הדלקת המאוחרת בשדה מיוצגים על ידי גנוטיפ אחד או יותר) נמצאים בכל מקום במדינות בהן גידול תפוחי האדמה מתבצע אך ורק על ידי חוות גדולות: ארה"ב, הולנד, דנמרק וכו '. באנגליה, אירלנד, פולין, בהן גם חלקות משק בית נפוצות באופן מסורתי. בגידול תפוחי אדמה, ישנו גיוון גנוטיפי גבוה יותר בגנים פרטיים. בסוף המאה ה -20 נפוצו "קווים משובטים" בחלקים האסיאתיים והמזרח הרחוק של רוסיה (Elansky et al., 2001), ככל הנראה כתוצאה משימוש באותם זנים של תפוחי אדמה אך ורק לשתילה. לאחרונה החל המצב באזורים אלה להשתנות לעבר גידול במגוון הגנוטיפי של האוכלוסיות.
להיעדר טיפולים אינטנסיביים בתכשירים קוטלי פטריות יש השלכה נוספת וישירה - אין הצטברות של זנים עמידים בגנים. ואכן, התוצאות שלנו מראות כי זנים עמידים למטאקסיל מצויים בתדירות נמוכה משמעותית בגנים פרטיים מאשר בנטיעות מסחריות.
הקרבה של נטיעות תפוחי אדמה ועגבניות, האופייניות לגינות פרטיות, מקלה על נדידת הזנים בין גידולים אלה, וכתוצאה מכך, בעשור האחרון, בין הזנים המבודדים מתפוחי אדמה, שיעור הזנים הנושאים את הגן לעמידות בפני זני עגבניות שרי (T1), שהיה אופייני קודם לכן רק עבור " זני עגבניות. זנים עם הגן T1 ברוב המקרים הם אגרסיביים ביותר כלפי תפוחי אדמה ועגבניות כאחד.
בשנים האחרונות החל דלקת מאוחרת על עגבניות להופיע במקרים רבים מוקדם יותר מאשר על תפוחי אדמה. שתילי עגבניות יכולים להיות מושפעים על ידי oospores באדמה, או oospores הקיימים בזרעי עגבניות או דבקים אליהם (Rubin et al., 2001). ב -15 השנים האחרונות הופיעו בחנויות מספר רב של זרעים ארוזים זולים, בעיקר מיובאים, ורוב היצרנים הקטנים עברו להשתמש בהם. הזרעים יכולים להביא זנים עם גנוטיפים האופייניים לאזורי גידולם. בעתיד, גנוטיפים אלה נכללים בתהליך המיני בגנים פרטיים, מה שמוביל להופעתם של גנוטיפים חדשים לחלוטין.
לפיכך, ניתן לקבוע כי גנים פרטיים הם "כור היתוך" עולמי, כתוצאה מהחלפת החומר הגנטי מעובדים גנוטיפים קיימים ומופיעים חדשים לחלוטין. יתר על כן, הבחירה שלהם מתבצעת בתנאים שונים מאוד מאלה שנוצרו עבור תפוחי אדמה בחוות גדולות: היעדר עיתונות פטרייתית, אחידות זנים של נטיעות, הדומיננטיות של צמחים שנפגעו מצורות שונות של זיהום נגיפי וחיידקי, קרבה לעגבניות ולגבעולי לילה פראיים, חצייה פעילה והיווצרות oospore, אפשרות עבור oospores לשמש מקור לזיהום בשנה הבאה.
כל זה מוביל למגוון גנוטיפי גבוה מאוד של אוכלוסיות בחצר האחורית. בתנאי האפיפיטוטיקה בגינות הירק, הדלקת המאוחרת מתפשטת במהירות רבה ומשתחררים כמויות עצומות של נבגים העפות לנטיעות מסחריות סמוכות. עם זאת, לאחר שנכנסו לשדות מסחריים עם מערכת נכונה של טכנולוגיה חקלאית והגנה כימית, לנבגים שהגיעו אין כמעט שום אפשרות ליזום חומרים אפיפיטוטיים בשטח, וזאת בשל היעדר קווים משובטים העמידים בפני קוטלי פטריות והתמחו במגוון המעובד.
מקור נוסף לחיסון ראשוני עשוי להיות פקעות חולות שנלכדו בשתילים מסחריים. פקעות אלו גודלו, ככלל, בשדות בעלי טכנולוגיה חקלאית טובה והגנה כימית אינטנסיבית. הגנוטיפים של הבודדים שהשפיעו על הפקעות מותאמים להתפתחות הזן שלהם. זנים אלה מסוכנים משמעותית לשתילה מסחרית מאשר חיסון שמקורו בגנים פרטיים. תוצאות מחקרינו תומכות גם בהנחה זו. אוכלוסיות מבודדות משדות גדולים עם הגנה כימית המתנהלת כראוי וטכנולוגיה חקלאית טובה אינן נבדלות במגוון הגנוטיפי הגבוה. לעתים קרובות מדובר בכמה קווים משובטים שהם אגרסיביים ביותר.
זנים מחומר זרעים מסחרי יכולים להיכנס לאוכלוסיות בגינות ירק ולהיות מעורבים בתהליכים המתרחשים בהם. עם זאת, בגן ירק, התחרותיות שלהם תהיה נמוכה בהרבה מאשר בתחום מסחרי, ובקרוב הם יפסיקו להתקיים בצורה של קו משובט, אך ניתן להשתמש בגנים שלהם באוכלוסיית ה"גן ".
הזיהום שמתפתח בצמחים "מתנדבים" ובערמות פקעות שנפסלו במהלך הקציר אינו כל כך רלוונטי עבור רוסיה, משום באזורים העיקריים של גידול תפוחי האדמה ברוסיה, נצפית הקפאת אדמת חורף עמוקה, ולעיתים נדירות מתפתחים צמחים מפקעות שחורפו באדמה. יתר על כן, כפי שמראים הניסויים שלנו, פתוגן הדלקת המאוחרת אינו שורד בטמפרטורות שליליות גם על פקעות ששמרו על כדאיותן. באזור הצחיח, בו מתרגלים גידול של תפוחי אדמה מוקדמים, דלקת מאוחרת נדירה למדי עקב עונת הגידול היבשה והחמה.
לפיכך, אנו צופים כעת בחלוקה של אוכלוסיות P. infestans לאוכלוסיות "שדה" ו"גן ". עם זאת, בשנים האחרונות נצפו תהליכים המובילים להתכנסות וחדירה של גנוטיפים מאוכלוסיות אלה.
ביניהם, ניתן לציין עלייה כללית באוריינותם של יצרנים קטנים, הופעת אריזות קטנות במחיר סביר של תפוחי אדמה, התפשטות תכשירים קוטליים באריזות קטנות, ואובדן החשש מפני "כימיה" מצד האוכלוסייה.
נוצרים מצבים שבזכות פעילות נמרצת של ספק אחד נטועים כפרים שלמים פקעות זרעים מאותו הזן ומסופקות עם אריזות קטנות של אותם חומרי הדברה. ניתן להניח שתפוחי אדמה מאותו זן ימצאו בנטיעות מסחריות בקרבת מקום.
מצד שני, חלק מחברות הסחר בהדברה מקדמות תוכניות לטיפול כימי "תקציביות". במקרה זה, אין לזלזל במספר הטיפולים המומלצים ומוצעים קוטלי הפטריות הזולים ביותר, והדגש הוא לא על מניעת התפתחות דלקת מאוחרת עד לכיסוח צמרות, אלא על עיכוב מסוים באפיפיטוטי כדי להגדיל את התשואה. תוכניות כאלה מוצדקות מבחינה כלכלית בעת גידול תפוחי אדמה של כלי תיבול מחומר זרעים בדרגה נמוכה, כשבאופן עקרוני אין כל השגה לקבלת תפוקה גבוהה. עם זאת, במקרה זה, בניגוד לאוכלוסיות הגן, הרקע הגנטי המפולס של תפוח האדמה תורם לבחירת הגזעים הפיזיולוגיים הספציפיים, המסוכנים מאוד לזן זה.
באופן כללי, הנטיות להתכנסות בין שיטות "גן" ו"שדה "לייצור תפוחי אדמה נראות לנו מסוכנות למדי. כדי למנוע את השלכותיהם השליליות, הן במגזר הביתי והן במגזר המסחרי, יהיה צורך לשלוט הן במבחר תפוחי האדמה והן במגוון של קוטלי הפטריות המוצעים לבעלים פרטיים באריזות קטנות, וכן במעקב אחר תוכניות הגנה על תפוחי אדמה ושימוש בקוטלי פטריות במגזר המסחרי.
באזורי המגזר הפרטי ישנה התפתחות אינטנסיבית של לא רק דלקת מאוחרת, אלא גם אלטרנריה. רוב הבעלים של חלקות בית פרטיות לא נוקטים אמצעים מיוחדים להגנה מפני אלטרנטריה, תוך שהם לוקחים את הפיתוח של אלטרנריה לצורך נבילה טבעית של העלווה או להתפתחות דלקת מאוחרת. לכן, עם התפתחותה המסיבית של אלטרנריה על זנים רגישים, חלקות ביתיות יכולות לשמש כמקור חיסון לנטיעות מסחריות.
מנגנוני שונות
תהליך מוטציה
מכיוון שהופעת מוטציות היא תהליך אקראי המתנהל בתדירות נמוכה, הופעת המוטציות בכל מוקד כלשהו תלויה בתדירות המוטציה של לוקוס זה ובגודל האוכלוסייה. כאשר בוחנים את תדירות המוטציות של זני P. infestans, בדרך כלל נקבע מספר המושבות שגדלו בתקשורת תזונתית סלקטיבית לאחר טיפול במוטגנים כימיים או פיזיים. כפי שניתן לראות מהנתונים המוצגים בטבלה 8, תדירות המוטציה של אותו זן במיקומים שונים יכולה להיות שונה בכמה סדרי גודל. התדירות הגבוהה של מוטציות בהתנגדות למטאקסיל עשויה להיות אחת הסיבות להצטברות זנים העמידים בפניו בטבע.
תדירות המוטציות הספונטניות או המושרות, המחושבת על בסיס ניסויים במעבדה, לא תמיד תואמת את התהליכים המתרחשים באוכלוסיות טבעיות, מהסיבות הבאות:
1. עם ביקוע גרעיני אסינכרוני, אי אפשר לאמוד את תדירות המוטציות לדור גרעיני אחד. לכן, רוב הניסויים מספקים מידע רק באופן ישיר על תדירות המוטציות, מבלי להבחין בין שני אירועי מוטציה לאירוע אחד בעקבות מיטוזה.
2. מוטציות חד-שלביות מפחיתות בדרך כלל את איזון הגנום, ולכן יחד עם רכישת נכס חדש, הכושר הכללי של האורגניזם פוחת. לרוב המוטציות שהושגו בניסוי יש אגרסיביות מופחתת ואינן מתועדות באוכלוסיות טבעיות. לפיכך, מקדם המתאם בין מידת העמידות של P. infestans מוטציות לקוטלי פטריות פנילאמיד לבין קצב הגידול במדיום מלאכותי היה בממוצע (-0,62), והעמידות בפני קוטלי פטריות ותוקפנות על עלי תפוחי אדמה (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), דבר המצביע על כושרם הנמוך של המוטציות. מוטציות של עמידות לדימתומורף לוו גם בירידה חדה בכדאיות (Bagirova et al., 2001).
3. רוב המוטציות הספונטניות המושרות הן רצסיביות ואינן מתבטאות בפנוטיפ בניסויים, אלא מהוות עתודה נסתרת של שונות באוכלוסיות טבעיות. זנים מוטנטים המבודדים בניסויים במעבדה נושאים מוטציות דומיננטיות או חצי דומיננטיות (Kulish and Dyakov, 1979). ככל הנראה, דיפלואידיות גרעינית מסבירה ניסיונות כושלים להשיג מוטציות בהשפעת הקרנת UV שהן ארסיות על זנים עמידים בעבר (McKee, 1969). על פי חישובי המחבר, מוטציות כאלה יכולות להתרחש בתדירות של פחות מ -1: 500000. המעבר של מוטציות רצסיביות למצב הומוזיגוטי ובא לידי ביטוי פנוטיפי יכול להתרחש עקב רקומבינציה מינית או מינית (ראה להלן). עם זאת, גם במקרה זה, ניתן להסוות את המוטציה על ידי האללים הדומיננטיים של גרעיני הבר הטבעיים בתאי התאים הסינוטיים (הרב-גרעיניים) ולתקן אותם פנוטיפית רק במהלך היווצרות זואוספורות חד גרעיניות.
טבלה 8. התדירות של P. infestans מוטציות לחומרים מעכבי גדילה תחת פעולת ניטרוזומאתיל אוראה (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
חיבור | תדירות המוטציה |
אוקסיטטרציקלין | 6,9 10 x-8 |
בלסטידין ס | X 7,2 10-8 |
סטרפטומיצין | 8,3 x10-8 |
טריכוטסין | 1,8 10 x-8 |
ציקלוהקסימיד | 2,1 10 x-8 |
דאאקוניל | <4 x 10-8 |
דימתומורף | 6,3 10 x-7 |
מטאלאקסיל | 6,9 10 x-6 |
גודל האוכלוסייה ממלא תפקיד מכריע גם בהתרחשות של מוטציות ספונטניות. באוכלוסיות גדולות מאוד, בהן מספר התאים N> 1 / a, כאשר a הוא שיעור המוטציה, המוטציה מפסיקה להיות תופעה אקראית (Kvitko, 1974).
חישובים מראים שעם התפשטות ממוצעת של שדה תפוחי אדמה (35 כתמים לצמח) נוצרים מדי יום נבגים של 8x1012 על דונם אחד (Dyakov and Suprun, 1984). ככל הנראה, אוכלוסיות כאלה מכילות את כל המוטציות המותרות לפי סוג החלפה בכל מוקד. אפילו מוטציה נדירה, המתרחשת בתדירות של 10-9, תרכוש על ידי אלף פרטים מתוך המיליונים החיים על דונם אחד של שדה תפוחי אדמה. עבור מוטציות המתרחשות בתדירות גבוהה יותר (למשל, 10-6), באוכלוסייה כזו, מוטציות מזווגות שונות יכולות להתרחש מדי יום (בו זמנית בשני לוקוסים), כלומר תהליך המוטציה יחליף רקומבינציה.
הגירות
עבור P. infestans ידועים שני סוגים עיקריים של נדידה: לסגור מרחקים (בתוך שדה תפוחי אדמה או שדות סמוכים) על ידי התפשטות zoosporangia על ידי זרמי אוויר או תרסיס גשם, ומרחקים ארוכים - עם שתילת פקעות או הובלת פירות עגבניות. השיטה הראשונה מספקת הרחבת מוקד המחלה, השנייה - יצירת מוקדים חדשים במקומות מרוחקים מהראשוני.
התפשטות ההדבקה בפקעות עגבניות ופירות תורמת לא רק להופעת המחלה במקומות חדשים, אלא היא גם המקור העיקרי למגוון הגנטי באוכלוסיות. באזור מוסקבה מגדלים תפוחי אדמה המובאים מאזורים שונים ברוסיה ובמערב אירופה. פירות עגבניות מובאים מהאזורים הדרומיים של רוסיה (אזור אסטרחן, אזור קרסנודאר, צפון הקווקז). זרעי עגבניות, שיכולים לשמש גם כמקור לזיהום (Rubin et al., 2001), מיובאים גם מהאזורים הדרומיים של רוסיה, סין, מדינות אירופה ומדינות אחרות.
על פי חישובים של E. Mayr (1974), שינויים גנטיים באוכלוסייה מקומית הנגרמת על ידי מוטציות לעיתים רחוקות עולים על 10-5 למיקום, בעוד שבאוכלוסיות פתוחות, חילופי הדברים עקב זרימת הנגד של הגנים הם לפחות 10-3 - 10-4.
הגירה בפקעות נגועות אחראית על כניסתם של P. infestans לאירופה, ומתפשטת לכל אזורי העולם בהם מגדלים תפוחי אדמה; הם גרמו לשינויים באוכלוסייה החמורים ביותר. דלקת מאוחרת בתפוחי אדמה הופיעה בשטח האימפריה הרוסית כמעט במקביל להופעתה במערב אירופה.
מאחר שהמחלה נצפתה לראשונה בשנים 1846-1847 במדינות הבלטיות ורק בשנים שלאחר מכן התפשטה בבלארוס ובאזורים הצפון מערביים של רוסיה, מוצאה המערבי-אירופי ברור. המקור הראשון לדלקת מאוחרת בעולם הישן אינו כה ברור. ההשערה שפותחה על ידי Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) מציעה כי הטפיל הגיע תחילה ממקסיקו לצפון אמריקה, שם התפשט דרך יבולים ואז הועבר למערב אירופה. (איור 7).
כתוצאה מההיסחפות החוזרת ונשנית (השפעה כפולה של "צוואר הבקבוק") הגיעו שיבוטים בודדים לאירופה, שצאצאיהם גרמו למגיפה בכל שטח העולם הישן, שם מגדלים תפוחי אדמה. כראיה להשערה זו, המחברים מצטטים, ראשית, את ההתרחשות בכל מקום של זיווג אחד בלבד (A1), ושנית, ההומוגניות של הגנוטיפים של הזנים הנחקרים מאזורים שונים (כולם מבוססים על סמנים מולקולריים, כולל 2 לוקוסים איזואיזמים, דפוסי טביעת אצבע של DNA, ו מבנה ה- DNA המיטוכונדריאלי זהה, ומתאים לשכפול US-1 המתואר בארה"ב). עם זאת, חלק מהנתונים מעלים ספקות לגבי לפחות חלק מההשערות המוצהרות. ניתוח של ה- DNA המיטוכונדריאלי של P. infestans מבודד מדגימות תפוחי אדמה של הרבריום שנדבקו במהלך התקופה האפיפיטוטית הראשונה של שנות ה -40 של המאה העשרים הראה כי הם נבדלים במבנה ה- DNA המיטוכונדריאלי משבוט US-1, אשר, אם כן, היה לפחות לא המקור היחיד לזיהום באירופה (Ristaino et al, 2001).
מצב הדלקת המאוחרת החמיר שוב בשנות ה -80 של המאה העשרים. השינויים הבאים התרחשו:
1) התוקפנות הממוצעת של האוכלוסייה גדלה, מה שהוביל, במיוחד, להתפשטות של הצורה המזיקה ביותר של הדלקת המאוחרת - פגיעה בעמוד הגבעול ובגבעולים.
2) חל שינוי בזמן הדלקת המאוחרת בתפוחי האדמה - מסוף יולי לתחילת יולי ואפילו עד סוף יוני.
3) סוג ההזדווגות A2, שנעדר בעבר בעולם הישן, הפך לכל מקום.
לשינויים קדמו שני אירועים: השימוש המסיבי בתכשיר הקוטל הפטרייתי החדש (Schwinn and Staub, 1980) והופעתה של מקסיקו כיצואנית תפוחי אדמה עולמית (Niederhauser, 1993). בהתאם לכך הועלו שתי סיבות לשינויים באוכלוסייה: הסבה של סוג ההזדווגות בהשפעת metalaxyl (Ko, 1994) והכנסה מסיבית של זנים חדשים עם פקעות נגועות ממקסיקו (Fry and Goodwin, 1995). למרות שהמרות מסוג הזדווגות בהשפעת מתכת-אקסיל הושגו לא רק על ידי קו, אלא גם בעבודות שבוצעו במעבדה של אוניברסיטת מוסקבה (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), ההשערה השנייה עדיפה. יחד עם הופעת הסוג השני של ההזדווגות, חלו שינויים חמורים בגנוטיפים של זני P. infestans הרוסים, כולל בגנים ניטרליים (איזוזים ו- RFLP loci), כמו גם במבנה ה- DNA המיטוכונדריאלי. לא ניתן להסביר את מורכבות השינויים הללו על ידי פעולת המטאל-אקסיל; אלא, היה ייבוא מסיבי של זנים חדשים ממקסיקו, אשר בהיותם אגרסיביים יותר (Kato et al., 1997), עקרו את הזנים הישנים (US-1) והפכו לדומיננטיים באוכלוסיות. השינוי בהרכב האוכלוסיות האירופיות התרחש תוך זמן קצר מאוד - משנת 1980 עד 1985 (Fry et al., 1992). בשטח ברית המועצות לשעבר נמצאו "זנים חדשים" באוספים מאסטוניה בשנת 1985, כלומר מוקדם יותר מאשר בפולין ובגרמניה (Goodwin et al., 1994). בפעם האחרונה "הזן הישן US-1" ברוסיה בודד מעגבנייה נגועה באזור מוסקבה בשנת 1993 (Dolgova et al., 1997). גם בצרפת, זנים "ישנים" נמצאו בנטיעות עגבניות עד תחילת שנות ה -90, כלומר לאחר שנעלמו זה מכבר על תפוחי אדמה (Leberton and Andrivon, 1998). שינויים בזנים P. infestans השפיעו על תכונות רבות, כולל תכונות בעלות חשיבות מעשית רבה, והגבירו את מזיקות הדלקת המאוחרת.
רקומבינציה מינית
על מנת שרקומבינציה מינית תורמת לשונות, יש צורך ראשית בהימצאותם של שני סוגי זיווג באוכלוסייה ביחס קרוב ל -1: 1, ושנית, נוכחות של שונות האוכלוסייה הראשונית.
היחס בין סוגי ההזדווגות משתנה מאוד באוכלוסיות שונות ואף בשנים שונות באוכלוסייה אחת (טבלה 9,10, 90). הסיבות לשינויים כה דרסטיים בתדירות סוגי ההזדווגות באוכלוסיות (כמו למשל ברוסיה או בישראל בתחילת שנות ה -2002 של המאה הקודמת) אינן ידועות, אך ההערכה היא כי הדבר נובע מהכנסת שיבוטים תחרותיים יותר (כהן, XNUMX).
כמה נתונים עקיפים מצביעים על מהלך התהליך המיני בשנים מסוימות ובאזורים מסוימים:
1) מחקרים על אוכלוסיות מאזור מוסקבה הראו כי אצל 13 אוכלוסיות בהן שיעור ההזדווגות של A2 היה פחות מ -10%, המגוון הגנטי הכולל המחושב לשלושה לוקים באיזוזים היה 0,08 וב 14 אוכלוסיות בהן שיעור ה- A2 חרג 30%, המגוון הגנטי היה גבוה פי שניים (0,15) (Elansky et al., 1999). כך שככל שהסבירות לקיום יחסי מין גבוהה יותר, כך המגוון הגנטי של האוכלוסייה גדול יותר.
2) הקשר בין יחס סוגי ההזדווגות באוכלוסיות לבין עוצמת היווצרות האוספורה נצפה בישראל (כהן ואח ', 1997) ובהולנד.
(פלייר ואח ', 2004). מחקרינו הראו כי באוכלוסיות שבהן מבודדים עם סוג ההזדווגות A2 היוו 62, 17, 9 ו -6%, נמצאו אובוספורות אצל 78, 50, 30 ו -15% מעלי תפוח האדמה הניתוחים (בעלי 2 כתמים או יותר), בהתאמה.
דוגמאות עם 2 נקודות או יותר הכילו באופן משמעותי אוספורות מאשר דגימות עם נקודה אחת (1 ו -32% מהדגימות בהתאמה) (Apryshko et al., 14).
Oospores היו הרבה יותר שכיחים בעלים של השכבה האמצעית והתחתונה של צמח תפוחי האדמה (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) באזורים מסוימים התגלו גנוטיפים ייחודיים שהופעתם קשורה לרקומבינציה מינית. כך, בפולין בשנת 1989 ובצרפת בשנת 1990, זנים הומוזיגוטיים לגלוקוז-6-
איזומרז פוספט (GPI 90/90). מאחר שקודם לכן רק 10/90 הטרוזיגוטים נתקלו במשך 100 שנים, הומוזיגוזיות מיוחסת לרקומבינציה מינית (Sujkowski et al., 1994). בקולומביה (ארה"ב) נפוצים מבודדים המשלבים A2 עם GPI 100/110 ו- A1 עם GPI 100/100, אולם בסוף עונת 1994 (16 באוגוסט ו- 9 בספטמבר), זנים עם גנוטיפים רקומביננטיים (A1 GPI 100/110 ו- A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) בחלק מהאוכלוסיות מפולין (Sujkowski et al., 1994) וצפון הקווקז (Amatkhanova et al., 2004), התפלגות לוקוסים של DNA של טביעות האצבע ו- loco חלבון תואמת להתפלגות הארדי-וויינברג, המציינת.
על החלק הגבוה של התרומה של רקומבינציה מינית לשונות האוכלוסיות. באזורים אחרים ברוסיה לא נמצאה התכתבות להתפלגות הארדי-וויינברג באוכלוסיות, אך נוכחות של חוסר שיווי משקל של הצמדה, מה שמעיד על השכיחות של רבייה משובטת (Elansky et al., 1999).
5) המגוון הגנטי (GST) בין זנים עם סוגי זיווג שונים (A1 ו- A2) היה נמוך יותר מאשר בין אוכלוסיות שונות (Sujkowski et al., 1994), מה שמעיד בעקיפין על צלבים מיניים.
יחד עם זאת, התרומה של רקומבינציה מינית למגוון האוכלוסייה אינה יכולה להיות גבוהה במיוחד. תרומה זו חושבה עבור אוכלוסיות אזור מוסקבה (Elansky et al., 1999). על פי החישובים של לבונטין (1979) "רקומבינציה, שיכולה לייצר וריאציות חדשות משני לוקוסים בתדירות שאינה עולה על תוצר ההטרוזיגוזיות שלהם, הופכת ליעילה רק אם ערכי ההטרוזיגוזיות עבור שני האללים כבר גבוהים".
עם היחס בין שני סוגי הזיווג, האופייני לאזור מוסקבה, השווה ל -4: 1, תדירות הרקומבינציה תהיה 0,25. ההסתברות שזנים חצויים יהיו הטרוזיגוטיים עבור שניים משלושת לוקוסי האיזוזים שנחקרו באוכלוסיות שנחקרו היו 0,01 (2 זנים מתוך 177). לכן, ההסתברות להתרחשות הטרוזיגוטים כפולים כתוצאה מרומבינציה לא צריכה לחרוג ממוצרם כפול ההסתברות למעבר (0,25x0,02x0,02) = 10-4, כלומר רקומביננטים מיניים בדרך כלל אינם נופלים למדגם הזנים שנחקר. חישובים אלה נעשו עבור אוכלוסיות מאזור מוסקבה, המאופיינות בשונות גבוהה יחסית. באוכלוסיות מונומורפיות כמו אלו הסיביריות, התהליך המיני, גם אם הוא מתרחש באוכלוסיות בודדות, אינו יכול להשפיע על המגוון הגנטי שלהן.
בנוסף, P. infestans מאופיין בכיוונון תדיר של כרומוזומים במיוזה, מה שמוביל לאנפלואידיות (Carter et al., 1999). הפרות כאלה מפחיתות את פוריותם של הכלאיים.
רקומבינציה פרה-מינית, המרת גנים מיטוטיים
בניסויים על שחבור של זנים של P. infestans עם מוטציות של עמידות בפני מעכבי גדילה שונים, נמצאה הופעתם של שינויים מוטים עמידים בפני שני המעכבים (שאטוק ושו, 1975; דיאקוב, קוזובניקובה, 1974; קוליש, דיאקוב,
1979). זנים עמידים לשני מעכבי גדילה התעוררו כתוצאה מהטרוקריוטיזציה של התפטיר, ובמקרה זה הם ביקעו במהלך ההתרבות על ידי זואוספורות חד גרעיניות (Judelson, Ge Yang, 1998), או לא ביקעו בצאצאים מונו-זמניים, מכיוון שהיה להם גרעינים טטרפלואידים (מכיוון שהבידודים הראשוניים הם דיפלואידים) (K 1979). דיפלואידים הטרוזיגיים מופרדים בתדירות נמוכה מאוד עקב הפלואידיזציה, הפרדת כרומוזום ולא מעבר מיטוטי (Poedinok et al., 1982). ניתן להגדיל את תדירות התהליכים הללו בעזרת פעולות מסוימות על דיפלואידים הטרוזיגוטיים (למשל, הקרנת UV של נבגים נובטים).
למרות היווצרותם של כלאיים צמחיים עם עמידות כפולה מתרחשת לא רק במבחנה, אלא גם בפקעות תפוחי אדמה הנגועות בתערובת של מוטציות (Kulish et al., 1978), די קשה להעריך את התפקיד של רקומבינציה פרה-מינית בדור גנוטיפים חדשים באוכלוסיות. תדירות היווצרותם של הסגרגטים עקב הפלואידליזציה, הפרדת כרומוזומים ללא הפרעה וחציית מיטוטיות ללא השפעות מיוחדות היא זניחה (פחות מ- 10-3).
הופעתם של סגרגנטים הומוזיגוטיים של זנים הטרוזיגוטים עשויה להתבסס על מעבר בין המיטוטי והן על המרה של גנים מיטוטיים, אשר ב- P. sojae מתרחשת בתדירות של 3 x 10-2 עד 5 x 10-5 לכל לוקוס, תלוי בזן (Chamnanpunt et al. , 2001).
למרות שתדירות ההופעה של הטרוקריונים ודיפלואידים הטרוזיגוטיים התבררה כגבוה באופן בלתי צפוי (מגיעה לעשרות אחוזים), אך תהליך זה מתרחש רק כאשר נחברים תרבויות מוטציות המתקבלות מאותו זן. כאשר משתמשים בזנים שונים המבודדים מהטבע, הטרוקריוטיזציה אינה מתרחשת (או מתרחשת בתדירות נמוכה מאוד) עקב נוכחות של חוסר תאימות וגטטיבי (Poedinok and Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). כתוצאה מכך, ניתן להפחית את התפקיד של רקומבינציה פרה-מינית רק לרקומבינציה תוך-קלונאלית בגרעינים הטרוזיגוטיים ומעבר של גנים בודדים למצב הומוזיגוטי ללא תהליך מיני. לתהליך זה יכולה להיות חשיבות אפידמיולוגית בזנים עם מוטציות עמידות לרציד נגד קוטלי פטריות רצסיביות או חצי דומיננטיות. המעבר למצב הומוזיגואי עקב התהליך הפרה-מיני, יגביר את התנגדות נשא המוטציה (דולגובה, דיאקוב, 1986).
התפרצות גנים
מינים הטרוטליים Phytophthora מסוגלים להשתלב עם היווצרותם של oospores היברידית (ראה Vorob'eva and Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). הכלאה הטבעית של שני מיני הפיטופטורה הייתה כה אגרסיבית עד שהרגה אלפי אלדרים בבריטניה (Brasier et al., 1999). P. infestans יכולים להופיע עם מינים אחרים מהסוג (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, וכו ') על צמחים מארחים נפוצים ובאדמה, אך יש מעט מידע בספרות על האפשרות של כלאיים בין-ספציפיים. בתנאי מעבדה הושגו כלאיים בין P. infestans ו- P. Mirabilis (Goodwin and Fry, 1994).
לוח 9. שיעור P. infestans זנים בעלי סוג ההזדווגות A2 במדינות שונות בעולם בתקופה שבין 1990 ל -2000 (על פי נתוני מקורות ספרות פתוחים ואתרים www.euroblight.net, www.eucablight.org)
מדינה | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
בלארוס | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
בלגיה | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
אקוודור | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
אסטוניה | 8 (12) | ||||||||||
אנגליה | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
פינלנד | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
צרפת | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
הונגרי | 72 (32) | ||||||||||
אירלנד | 4 (145) | ||||||||||
צָפוֹן. אירלנד | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
הולנד | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
נורבגיה | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
פרו | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
פולין | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
סקוטלנד | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
שוודיה | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
ויילס | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
קוריאה | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
סין | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
קולומביה | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
אורוגוואי | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
מרוקו | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
מקסיקו (טולוקה) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
לוח 10. שיעור P. infestans זנים בעלי סוג הזדווגות A2 במדינות שונות בעולם בתקופה שבין 2000 ל 2011
מדינה | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
אוסטריה | 65 (83) | ||||||||||
בלארוס | 42 (78) | ||||||||||
בלגיה | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
שוויץ | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
גרמניה | 95 (53) | ||||||||||
דנמרק | 48 (52) | ||||||||||
אקוודור | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
אסטוניה | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
אנגליה | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
פינלנד | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
צרפת | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
הונגרי | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
צָפוֹן. אירלנד | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
הולנד | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
נורבגיה | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
פרו | 0 (36) | ||||||||||
פולין | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
סקוטלנד | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
שוודיה | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
סלובקיה | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
ויילס | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
קוריאה | 46 (26) | ||||||||||
ברזיל | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
סין | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
וייטנאם | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
אוגנדה | 0 (8) |
דינמיקה של ההרכב הגנוטיפי של אוכלוסיות
שינויים בהרכב הגנוטיפי של אוכלוסיות P. infestans יכולים להתרחש בהשפעת הגירה של שיבוטים חדשים מאזורים אחרים, פרקטיקות חקלאיות (שינוי זנים, יישום קוטלי פטריות) ותנאי מזג אוויר. השפעות חיצוניות משפיעות על שיבוטים שונים בשלבים שונים של מחזור החיים; לכן אוכלוסיות חשות מדי שנה שינויים מחזוריים בתדירות הגנים הכפופים לבחירה, עקב שינוי בתפקיד הדומיננטי של סחף ובחירת גנים.
השפעת המגוון
זנים חדשים עם גנים יעילים להתנגדות אנכית (R-genes) הם גורם סלקטיבי רב-עוצמה, בבחירת שיבוטים עם גנים ארסיים משלימים באוכלוסיות P. infestans. בהיעדר עמידות לא ספציפית בזן תפוחי האדמה, המעכב את צמיחת אוכלוסיית הפתוגן, תהליך שינוי השיבוטים הדומיננטיים באוכלוסיה מתרחש במהירות רבה. לפיכך, לאחר התפשטות זן Domodedovsky באזור מוסקבה, בעל גן העמידות R3, תדירות השיבוטים הארסיים לזן זה עלתה מ- 0,2 ל- 0,82 בשנה אחת (Dyakov and Derevjagina, 2000).
עם זאת, השינוי בתדרים של גנים ארסיים (פתוטיפים) באוכלוסיות מתרחש לא רק בהשפעת זני תפוחי אדמה מעובדים. לדוגמא, בבלארוס עד 1977 שלטו שיבוטים עם גנים ארסיים 1 ו -4, אשר נגרמו על ידי גידול זני תפוחי אדמה עם גנים עמידים R1 ו- R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). עם זאת, בסוף שנות ה -70 של המאה העשרים, הופיעו שיבוטים עם גנים ארסיים שונים ושילובים שלהם, וגני ההתנגדות המשלימים מעולם לא שימשו בגידול תפוחי אדמה (גנים ארסיים נוספים) (Ivanyuk et al., 2002). הסיבה להופעתם של שיבוטים כאלה נובעת ככל הנראה מהגירה לאירופה של חומר זיהומי ממקסיקו עם פקעות תפוחי אדמה. בבית, שיבוטים אלה התפתחו לא רק על תפוחי אדמה מעובדים, אלא גם על מיני בר הנושאים מגוון גנים של עמידות; לכן, השילוב של גנים ארסיים רבים בגנום היה הכרחי להישרדות בתנאים אלה.
באשר לזנים בעלי עמידות לא ספציפית, הם, על ידי הפחתת קצב ההתרבות של הפתוגן, מעכבים את התפתחות אוכלוסיותיו, שכפי שכבר הוזכר היא פונקציה של מספר. מכיוון שאגרסיביות היא פוליגנית, שיבוטים המכילים מספר רב יותר של גנים ל"אגרסיביות "מצטברים ככל שממוצע האוכלוסייה יהיה גבוה יותר. לכן, גזעים אגרסיביים ביותר אינם תוצר של הסתגלות לזנים מעובדים בעלי עמידות לא ספציפית, אלא להפך, סביר יותר שהם יתגלו בנטיעות של זנים רגישים מאוד שהם מצברים של נבגי הטפיל.
לפיכך, ברוסיה נמצאו האוכלוסיות האגרסיביות ביותר של P. Infestans באזורי אפיפיטוטים שנתיים (אוכלוסיות מאזורי סחלין, לנינגרד ובריאנסק). התוקפנות של אוכלוסיות אלה התבררה כגדולה מזו של האוכלוסיות המקסיקניות (פיליפוב ואח ', 2004).
בנוסף, נוצרים פחות אוספורות בעלים של זנים עמידים מאשר אצל רגישים (Hanson and Shattock, 1998), כלומר העמידות הלא ספציפית של הזן מפחיתה גם את יכולות הרקומבינציה של הטפיל ואת האפשרות לשיטות חורף אלטרנטיביות.
השפעת קוטלי פטריות
קוטלי פטריות לא רק מפחיתים את מספר הפטריות הפיטופתוגניות, כלומר. משפיעים על המאפיינים הכמותיים של אוכלוסיותיהם, אך הם יכולים גם לשנות את התדרים של גנוטיפים בודדים, כלומר להשפיע על הרכב האוכלוסיות האיכותי. בין המדדים החשובים ביותר לאוכלוסיות המשתנות בהשפעת קוטלי פטריות ניתן למנות את השינויים הבאים: שינויים בעמידות בפני קוטלי פטריות, שינויים באגרסיביות וארסיות ושינויים במערכות רבייה.
השפעת קוטלי פטריות על ההתנגדות והתוקפנות של אוכלוסיות
מידת ההשפעה הזו נקבעת, קודם כל, על פי סוג הקוטל הפטריטי בשימוש, אותו ניתן לחלק באופן מותנה לפוליסיט, אוליגוסיט ומונוציט.
הראשון כולל את רוב הקוטלי פטריות המגע. ההתנגדות אליהם (אם בכלל אפשרית) נשלטת על ידי מספר רב של גנים אקספרסיביים מאוד חלשים. מאפיינים אלה קובעים את היעדר השינויים הגלויים בהתנגדות האוכלוסייה לאחר טיפול בקוטלי פטריות (אם כי בחלק מהניסויים הושגה עלייה מסוימת בהתנגדות). אוכלוסיית הפטריות שנשתמרה לאחר ריסוס עם קוטלי פטריות מגע מורכבת משתי קבוצות של זנים:
1) זנים המשומרים באזורי צמחים שאינם מטופלים בתרופה. מכיוון שלא היה קשר עם קוטל הפטריות, התוקפנות והעמידות של זנים אלה אינם משתנים.
2) זנים במגע עם קוטל הפטריות, שריכוזם בנקודות המגע היה מתחת לקטלני. כאמור לעיל, גם ההתנגדות של חלק זה של האוכלוסייה אינה משתנה, אולם בשל ההשפעה המזיקה החלקית של קוטל הפטרייה אפילו בריכוז תת-קטלני על חילוף החומרים של התא הפטרייתי, הכושר הכללי ומרכיבו הטפילי, אגרסיביות, ירידה (Derevyagina ו- Dyakov, 1990).
לפיכך, גם לחלק מהאוכלוסייה שלא מתה, נחשף למגע עם קוטל הפטריות, יש אגרסיביות חלשה ולא יכול להוות מקור לאפיפיטוטיקה. לכן טיפול זהיר המפחית את תדירות שיעור האוכלוסייה שאינו במגע עם קוטל הפטריות הוא תנאי להצלחת אמצעי המגן. העמידות בפני קוטלי פטריות אוליגוסיטים נשלטת על ידי כמה גנים מוספים.
מוטציה של כל גן מובילה לעלייה מסוימת בעמידות, ומידת ההתנגדות הכוללת נובעת מהתוספת של מוטציות כאלה. לכן, העלייה בהתנגדות מתרחשת בשלבים. דוגמה לעלייה בשלבים בהתנגדות הן מוטציות בהתנגדות לקוטל הפטריות dimethomorph, הנמצא בשימוש נרחב להגנה על תפוחי אדמה מפני דלקת מאוחרת. עמידות לדימתומורף היא פוליגנית ותוסף. מוטציה בצעד אחד מגבירה מעט את ההתנגדות.
כל מוטציה שלאחר מכן מקטינה את גודל היעד וכתוצאה מכך את תדירות המוטציות הבאות (Bagirova et al., 2001). הגידול בהתנגדות הממוצעת של האוכלוסייה לאחר טיפולים חוזרים ונשנים עם קוטל הפטריות האוליגוסיטי מתרחש באופן הדרגתי. מהירות התהליך נקבעת על ידי שלושה גורמים לפחות: תדירות המוטציה של גני התנגדות, מקדם ההתנגדות (היחס בין המינון הקטלני של זן עמיד ביחס לזה הרגיש) והשפעת המוטציות בגנים העמידים על הכושר.
תדירות ההתרחשות של כל מוטציה עוקבת נמוכה יותר מזו הקודמת, ולכן התהליך הוא בעל אופי דעיכה (Bagirova et al., 2001). עם זאת, אם באוכלוסייה מתרחשים תהליכי רקומבינציה (מיניים או פרה-מיניים), ניתן לשלב מוטציות הוריות שונות בזן היברידי ולהאיץ את התהליך. לכן, אוכלוסיות panmix רוכשות התנגדות מהירה יותר מזו האגמית, ובאחרונה אוכלוסיות שאין בהן מחסומי אי-התאמה וגטטיבית מהר יותר מאוכלוסיות המחולקות על ידי מחסומים כאלה. בהקשר זה, נוכחותם של זנים באוכלוסיות השונות בסוגי ההזדווגות מאיצה את תהליך רכישת ההתנגדות לקוטלי פטריות אוליגוסיטים.
הגורם השני והשלישי אינם תורמים להצטברות מהירה של זנים עמידים לדימתומורף באוכלוסיות. כל מוטציה שלאחר מכן מכפילה בערך את ההתנגדות, שאינה משמעותית, ובמקביל מפחיתה גם את קצב הצמיחה בסביבה מלאכותית וגם את האגרסיביות (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). אולי בגלל זה אין כמעט זנים עמידים בקרב זני P. infestans הטבעיים, אפילו אלה שנאספו מטעי תפוחי אדמה שטופלו בדימתומורף.
אוכלוסייה שטופלה בקוטל פטריות אוליגוזיט תורכב גם משתי קבוצות של זנים: אלו שלא היו בקשר עם קוטל הפטריות, ולכן לא שינו את התכונות המקוריות (אם נמצאים קבוצה זו זנים עמידים, הם לא יצטברו בגלל האגרסיביות הגבוהה יותר והתחרותיות של זנים רגישים), וזנים במגע עם ריכוזי תת-קטלני של קוטל הפטרייה. זה בין האחרונים שהצטברות של זנים עמידים היא אפשרית, מכיוון שכאן יש להם יתרונות על פני רגישים.
לכן, כאשר משתמשים בקוטלי פטריות אוליגוסיטים, לא מדובר בטיפול יסודי שחשוב כי הוא ריכוז גבוה של התרופה, גבוה פי כמה מהמינון הקטלני, מכיוון שבאמצעות מוטגנזה בשלבים, ההתנגדות הראשונית של זנים מוטציה נמוכה.
לבסוף, מוטציות בהתנגדות לקוטלי פטריות חד-צדדיים הן אקספרסיביות ביותר, כלומר מוטציה אחת יכולה לדווח על רמת עמידות גבוהה עד לאובדן מוחלט של הרגישות. לכן העלייה בהתנגדות האוכלוסיות מתרחשת במהירות רבה.
דוגמה לקוטלי פטריות כאלה הם פנילמידים, כולל קוטל הפטריות הנפוץ ביותר. מוטציות של עמידות אליו נוצרות בתדירות גבוהה, ומידת ההתנגדות במוטציות היא גבוהה מאוד - היא חורגת מהמתח הרגיש בגורם של אלף ויותר (Derevyagina et al., 1993). למרות שקצב הצמיחה והאגרסיביות של מוטציות עמידות פוחת על רקע מותם של זנים רגישים מקוטל פטריות מערכתי, מספר האוכלוסייה העמידה גדל במהירות ובמקביל, האגרסיביות שלה גוברת. לכן, לאחר מספר שנים של שימוש בקוטל הפטריות, האגרסיביות של זנים עמידים יכולה לא רק להשתוות לאגרסיביות של רגישים, אלא גם להתעלות עליה (Derevyagina, Dyakov, 1992).
השפעה על רקומבינציה מינית
מאחר שההופעה התכופה של סוג ההזדווגות A2 באוכלוסיות P. infestans חפפה את השימוש האינטנסיבי במטאקסיל כנגד דלקת מאוחרת, הוצע כי מטאלקסיל גורם להמרה מסוג ההזדווגות. ב- P. parasitica הוכחה ניסוי המרה כזו תחת פעולת כלורונב ומתכת-אקסיל (Ko, 1994). מעבר בודד על מדיום עם ריכוז נמוך של מטקסיל הוביל להופעתם של מבודדים הומוטאליים מזן של P. infestans הרגיש למטאקסיל עם סוג ההזדווגות A1 (Savenkova and Cherepnikova-Anikina, 2002). במהלך מעברים שלאחר מכן על מדיה עם ריכוז גבוה יותר של מתכת-אקסיל, לא התגלה מבודד אחד מסוג הזיווג A2, עם זאת, רוב הבודדים, כאשר חצו אותם עם בידודים A2, במקום oospores, יצרו הצטברויות של תפטיר מכוער והיו סטריליים. מעברים של זן עמיד בעל סוג ההזדווגות A2 על מדיה עם ריכוז גבוה של מתכת-אקסיל אפשרו לנו לזהות שלוש צורות של שינויים בסוג ההזדווגות: 1) סטריליות מוחלטת כאשר עוברים אותה עם מבודדי A1 ו- A2; 2) הומוטאליזם (היווצרות אוספורות בתרבית חד-תרבותית); 3) המרה מסוג הזיווג A2 ל- A1. לפיכך, metalaxyl יכול לגרום לשינויים בסוג ההזדווגות באוכלוסיות P. infestans וכתוצאה מכך, רקומבינציה מינית אצלם.
השפעות על רקומבינציה צמחית
חלק מהגנים העמידים לאנטיביוטיקה הגבירו את תדירות ההטרוקריוטיזציה ההיפית והדיפלואידיזציה הגרעינית (Poedinok and Dyakov, 1981). כפי שצוין קודם לכן, heterokaryotization של hyphae במהלך היתוך של זנים שונים של P. infestans מתרחשת לעתים רחוקות מאוד בגלל התופעה של חוסר תאימות צמחית בפטרייה זו. עם זאת, לגנים לעמידות לאנטיביוטיקה מסוימת עלולות להיות תופעות לוואי המתבטאות בהתגברות על חוסר תאימות וגטטיבי. נכס זה היה בידי הגן העמיד למוטציה לסטרפטומיצין 1S-1. הימצאותם של מוטציות כאלה באוכלוסיות השדה של פיטופתורה יכולה להגביר את זרימת הגנים בין הזנים ולהאיץ את התאמת האוכלוסייה כולה לזנים או קוטלי פטריות חדשים.
קוטלי פטריות ואנטיביוטיקה מסוימים יכולים להשפיע על תדירות המחזור המיטוטי, דבר שיכול גם לשנות את תדירות הגנוטיפ באוכלוסיות. קוטל הפטריות הנפוץ נקשר לבטא-טובולין, חלבון שממנו נבנים מיקרו-צינורות של השלד הציטוני, ומשבש בכך את תהליכי הפרדת הכרומוזום באנאפאזה של המיטוזה, מה שמגדיל את תדירות הרקומבינציה המיטוטית (Hastie, 1970).
לקוטל הפטריות פארא-פלואורופנילאלנין, המשמש לטיפול במחלות הולנדיות אצל בוקיצה, יש את אותו המאפיין. Para-fluorophenylalanine הגביר את תדירות הרומבינציה בדיפלואידים הטרוזיגוטיים P. infestans (Poedinok et al., 1982).
שינויים מחזוריים בהרכב הגנוטיפי של אוכלוסיות במחזור החיים של P. infestans
מחזור ההתפתחות הקלאסי של P. infestans באזור הממוזג מורכב מארבעה שלבים.
1) שלב הגידול האקספוננציאלי של האוכלוסייה (שלב רב-מחזורי) עם דורות קצרים. שלב זה מתחיל בדרך כלל ביולי ונמשך 1,5-2 חודשים.
2) שלב עצירת גידול האוכלוסייה עקב ירידה חדה בשיעור הרקמות הלא מושפעות או התפרצות תנאי מזג אוויר לא טובים. שלב זה בחוות המבצעות פינוי עלים מוקדם לפני הקציר נושר מחוץ למחזור השנתי.
3) שלב החורף בפקעות, מלווה בירידה משמעותית בגודל האוכלוסייה עקב זיהום מקרי של פקעות, התפתחות איטית של זיהום בהם, היעדר זיהום מחדש של פקעות, נרקב וקטילת פקעות שנפגעו בתנאי אחסון רגילים.
4) שלב ההתפתחות האיטי בקרקע ובשתילים (שלב חד-מחזורי), בו משך הייצור יכול להגיע לחודש ומעלה (סוף מאי - תחילת יולי). בדרך כלל בשלב זה קשה לזהות עלים חולים, אפילו עם תצפיות מיוחדות.
שלב גידול אוכלוסין אקספוננציאלי (שלב רב-מחזורי)
תצפיות רבות (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) הראו שבתחילת האפיפיטוטיות, שיבוטים נמוכים-ארסיים ותוקפניים מעט, אשר מוחלפים לאחר מכן בתופעות ארסיות ותוקפניות יותר. קצב הצמיחה של התוקפנות של האוכלוסייה הוא גבוה יותר, כך מגוון הצמח המארח עמיד פחות.
ככל שהאוכלוסייה גדלה, ריכוז הגנים החשובים באופן סלקטיבי המוכנס לזנים מסחריים (R1-R4) וגם ניטרלי באופן סלקטיבי (R5-R11) עולה. אז באוכלוסיות ליד מוסקבה בשנת 1993, הארסיות הממוצעת מסוף יולי עד אמצע אוגוסט עלתה מ -8,2 ל -9,4, והעלייה הגדולה ביותר נצפתה לגן הארסיות הנייטרלי הסלקטיבי R5 (בין 31 ל -86% מהשיבוטים הארסיים) (Smirnov, 1996 ).
ירידה בקצב הגידול של אוכלוסייה מלווה בירידה בפעילות הטפילית של האוכלוסייה. לכן, בשנים דיכאוניות, גם מספר הגזעים הכולל וגם שיעור הגזעים הארסיים ביותר בהשוואה לאלה האפיפיטוטיים (Borisenok, 1969). אם בשיא תנאי מזג האוויר האפיפיטוטיים משתנים לבלתי שליליים עבור הדלקת המאוחרת ותפוחי האדמה יורדים, הריכוז של שיבוטים ארסיים ואגרסיביים ביותר פוחת גם (Rybakova et al., 1987).
העלייה בתדירות הגנים המשפיעים על ארסיות ותוקפנות של האוכלוסייה עשויה להיות כתוצאה ממבחר שיבוטים ארסיים ואגרסיביים יותר בקרב האוכלוסייה המעורבת. כדי להדגים את הבחירה פותחה שיטה לניתוח מוטציות ניטרליות, ששימשה בהצלחה באוכלוסיות כימוסטט של שמרים (Adams et al., 1985) ו- Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
תדירות המוטציות העמידות לבלסטידין S באוכלוסיית השדה של P. infestans פחתה במקביל לגידול באגרסיביות האוכלוסייה, מה שמעיד על שינוי בשבוטים הדומיננטיים במהלך גידול האוכלוסייה (Rybakova et al., 1987).
שלב חורף בפקעות
במהלך החורף בפקעות תפוחי אדמה, הארסיות והאגרסיביות של זני P. infestans יורדות, והירידה בארסיות מתרחשת לאט יותר מאגרסיביות (Rybakova and Dyakov, 1990). ככל הנראה, בתנאים התורמים לצמיחה מהירה של גודל האוכלוסייה (ר-סלקציה), גנים ארסיים "נוספים" ואגרסיביות גבוהה מועילים, לפיכך התפתחות של אפיפיטוטיקה מלווה בבחירת השיבוטים הארסיים והתוקפניים ביותר. בתנאי רוויה של הסביבה, כאשר לא קצב ההתרבות, אלא ההתמדה בקיום בתנאים שליליים (בחירת K) ממלא תפקיד חשוב, גנים "אקסטרים" של ארסיות ותוקפנות מפחיתים את הכושר, ושיבוטים עם גנים אלה הם הראשונים לגווע, כך שהתוקפנות הממוצעת הארסיות של האוכלוסייה הולכת ויורדת.
שלב הצמחייה בקרקע
שלב זה הוא המסתורי ביותר במחזור החיים (Andrivon, 1995). קיומו מוערך באופן ספקולטיבי בלבד - בגלל היעדר מידע על מה שקורה לפתוגן לאורך תקופה ארוכה (לפעמים יותר מחודש) - מהופעת שתילי תפוחי אדמה ועד להופעת הכתמים הראשונים של המחלה עליהם. על בסיס תצפיות וניסויים שוחזרה התנהגות הפטרייה בתקופת חיים זו (Hirst and Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
נבג של הפטרייה יכול להיווצר על פקעות נגועות בקרקע. הנבגים שנוצרו נובטים עם היפות, שיכולות לצמח לאורך זמן בקרקע. נבגים ראשוניים (נוצרים על פקעות) ומשניים (על התפטיר באדמה) עולים אל פני הקרקע על ידי זרמים נימים, אך רוכשים יכולת להדביק תפוחי אדמה רק לאחר העלים התחתונים שלהם יורדים ובאים במגע עם פני האדמה. עלים כאלה (כלומר, הכתמים הראשונים של המחלה נמצאים עליהם) אינם נוצרים מיד, אלא לאחר צמיחה והתפתחות ממושכת של צמרות תפוחי אדמה.
לפיכך, שלב הצמחייה הספרוטרופית יכול להתקיים גם במחזור החיים של P. infestans. אם בשלב הטפילי של מחזור החיים האגרסיביות היא המרכיב החשוב ביותר בכושר, הרי שבשלב הספרוטרופי מכוון להפחתת התכונות הטפיליות, כפי שהוכח בניסוי עבור כמה פטריות פיטופתוגניות (ראה Carson, 1993). לכן, בשלב זה של המחזור, יש לאבד את המאפיינים האגרסיביים ביותר. אך עד כה לא נערכו ניסויים ישירים המאששים את ההנחות הנ"ל.
שינויים עונתיים משפיעים לא רק על התכונות הפתוגניות של P. infestans, אלא גם על העמידות בפני קוטלי פטריות, הצומחת בשלב הפולי-מחזורי (במהלך אפיפיטוטות), ופוחתת במהלך אחסון החורף (Derevyagina et al., 1991; Kish and Cohen, 1992). נצפתה ירידה עזה במיוחד בהתנגדות למטאקסיל בתקופה שבין נטיעת הפקעות שנפגעו לבין הופעת הכתמים הראשונים של המחלה בשטח.
התמחות תוך-ספציפית והתפתחותה
P. infestans גורם למגיפות בשני גידולים חשובים מסחרית, תפוחי אדמה ועגבנייה. אפיפוטוטות על תפוחי אדמה החלו זמן קצר לאחר שהפטרייה נכנסה לאזורים חדשים. תבוסת העגבניה צוינה גם זמן קצר לאחר הופעת ההדבקה בתפוחי אדמה, אך תופעות על עגבניות נצפו רק מאה שנים מאוחר יותר - באמצע המאה ה -XNUMX. הנה מה שהלגלי ונידערהאוזר כותבים על תבוסת העגבניות בארה"ב
(1962): “במשך כמאה שנים לאחר התקופה האפיפיטוטית הקשה של 100, נעשו מעט או כמעט לא ניסיונות להשיג זנים עמידים של עגבניות. למרות שדלקת מאוחרת נרשמה לראשונה על עגבניות כבר בשנת 1845, היא לא הפכה למושא תשומת לב רצינית של מגדלים על צמח זה עד להתפרצות חזקה של המחלה בשנת 1848. בשטח רוסיה נרשם במאה ה -1946 דלקת עגבניות מאוחרת. "במשך זמן רב החוקרים לא שמו לב למחלה זו, מכיוון שהיא לא גרמה לנזק כלכלי משמעותי. אבל בשנות ה -60 וה -70. בברית המועצות נצפות גם מגלות של המאה ה -1979 של הדלקת המאוחרת בעגבניות, בעיקר באזור הוולגה התחתון, באוקראינה, בצפון הקווקז, במולדובה ... "(Balashova, XNUMX).
מאז הדלקת העגבניות בדלקת המאוחרת הפכה לשנתית, התפשטה בכל שטח הגידול התעשייתי והביתי וגורמת נזק כלכלי עצום לגידול זה. מה קרה? מדוע הופעתו הראשונה של הטפיל על תפוחי אדמה והנגע האפיפיטוטי של תרבות זו התרחשו כמעט בו זמנית, בעוד שלקח מאה שנה עד שהאפיפיטוטי הופיע על העגבנייה? הבדלים אלה תומכים במקור זיהום מקסיקני ולא דרום אמריקאי. אם המין Phytophthora infestans נוצר כטפיל של מינים נושאי פקעת מהסוג סולנום, ניתן להבין מדוע תפוחי אדמה מעובדים השייכים לאותו קטע מהמין כמו המין המקסיקני הושפעו כל כך, אך בשל היעדר התפתחות משותפת עם הטפיל, שלא פיתחה מנגנוני עמידות ספציפיים ולא ספציפיים.
עגבניה שייכת לחלק אחר בסוג, לסוג החלפה שלה יש הבדלים משמעותיים ממינים פקעתיים, על אף העובדה שהעגבנייה אינה מחוץ להתמחות המזון של P. infestans, עוצמת הנזק שלה לא הייתה מספקת להפסדים כלכליים חמורים.
הופעתן של אפיפוטוטות על עגבניה נובעת משינויים גנטיים חמורים בטפיל, שהגבירו את כושרו (פתוגניות) במהלך טפיל. אנו מאמינים כי הצורה החדשה המתמחה בהפנמת טפילי העגבניות היא גזע ה- T1 המתואר על ידי מ 'גלגלי, ומשפיע על זנים של עגבניות שרי (דובדבן אדום, אוטווה), עמיד בפני מרוץ T0 הנפוץ על תפוחי אדמה (Gallegly, 1952). ככל הנראה, מוטציה (או סדרת מוטציות) שהפכה את מירוץ ה- T0 למירוץ T1 והובילה להופעתם של שיבוטים המותאמים מאוד להביס עגבניה. כפי שקורה לעיתים קרובות, עלייה בפתוגניות אצל מארח אחד לוותה בירידה בה לאחרת, כלומר התעוררה התמחות אינטר-ספציפית ראשונית, טרם מלאה - לתפוחי אדמה (גזע T0) ולעגבנייה (גזע T1).
מהן הראיות להנחה זו?
- הופעה על תפוחי אדמה ועגבניות. על עלי עגבניות גזע T1 שולט ואילו על עלי תפוחי אדמה הוא נדיר. לדברי S.F. Bagirova ו- T.A. אורשונקובה (לא פורסם) באזור מוסקבה בשנים 1991-1992, הופעת מרוץ T1 בנטיעות תפוחי אדמה הייתה 0% ובנטיעות עגבניות - 100%; בשנים 1993-1995 - 33% ו -90% בהתאמה; בשנת 2001 - 0% ו 67%. נתונים דומים התקבלו בישראל (כהן, 2002). ניסויים בהדבקה של פקעות תפוחי אדמה עם מבודדי גזע T1 ותערובת של מבודדים T0 ו- T1 הראו כי בידודים של גזע T1 נשמרים בצורה גרועה בפקעות ומוחלפים בבודדים של גזע T0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) דינמיקה של מרוץ T1 בנטיעות עגבניות. זיהום ראשוני של עלי עגבניות מתבצע על ידי מבודדים של גזע ה- T0, השולטים בניתוח הזיהום בנקודות הראשונות שנוצרו על העלים. זה מאשש את התוכנית המקובלת של נדידת הטפילים: המסה העיקרית של זיהום מתפוחי אדמה מורכבת ממירוץ T0, אולם מספר קטן של שיבוטים T1 שנשמרו בתפוחי אדמה, פעם אחת על העגבנייה, מעקור את מרוץ T0 ומצטבר לקראת סוף התקופה האפיפיטוטית. יתכן גם שיש מקור חלופי לזיהום בעלים של עגבניות עם גזע ה- T1, שאינו חזק כמו פקעות ועלים של תפוחי אדמה, אך קבוע. לכן, למקור זה יש השפעה חלשה על המבנה הגנטי של האוכלוסייה המדביקה בעגבניות, אך לאחר מכן קובע את הצטברות מרוץ ה- T1 (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) תוקפנות לתפוחי אדמה ועגבניות. זיהום מלאכותי של עלי עגבניות ותפוחי אדמה עם מבודדים מהגזעים T0 ו- T1 הראה כי הראשונים אגרסיביים יותר עבור תפוחי אדמה מאשר עגבניות, והאחרונים אגרסיביים יותר עבור עגבניות מאשר לתפוח אדמה. הבדלים אלה באים לידי ביטוי בתזוזה של מבודדים של גזע שאינו "משלו" מאוכלוסייה מעורבת במהלך מעברי עלים בחממה (Dyakov et al., 1975) ובעלילות שדה (Leberton et al., 1999); הבדלים בעומס הזיהומי המינימלי, תקופת ההשהיה, גודל הנקודות המדבקות וייצור נבגים (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
האגרסיביות של מבודדי גזע ה- T1 לזני עגבניות חסרי גנים של עמידות היא כה גבוהה עד כי מבודדים אלה נבגים על עלים כמו על מדיום מזין מבלי לנמק את הרקמה הנגועה (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) ארסיות לתפוחי אדמה ועגבניות. גזע ה- T1 משפיע על זני עגבניות שרי עם הגן העמיד Ph1, בעוד ש- T0 אינו מסוגל להדביק זנים אלה, כלומר. יש ארסיות צרה יותר. ביחס למבדלים
גנים ה- R של תפוחי האדמה קשורים הפוך, כלומר זנים מבודדים מעלי עגבניה פחות ארסיים מזני "תפוח אדמה" (טבלה 11).
5) סמנים ניטרליים. הניתוח של סמנים ניטרליים באוכלוסיות P. infestans הטפיל על תפוחי אדמה ועגבניות מעיד גם על הבחירה התוך-ספציפית רב-כיוונית. באוכלוסיות הברזילאיות של P. infestans, מבודדי עלי עגבניות השתייכו לקו המשובט US-1, ואלה מעלי תפוחי אדמה השתייכו לקו BR-1 (Suassuna et al., 2004). בפלורידה (ארה"ב), מאז 1994, שיבוט US-90 החל לשלוט על תפוחי אדמה (עם הופעה של יותר מ -8%), ומשובטים US-11 ו- US-17 על עגבניות, והמבודדים של האחרון הם אגרסיביים יותר לגבי עגבניות מאשר לתפוח אדמה (Weingartner , Tombolato, 2004). הבדלים משמעותיים בתדרים של גנוטיפ (טביעות אצבעות DNA) בבודדי תפוחי אדמה ועגבניות נקבעו עבור 1200 זני P. infestans שנאספו בארצות הברית בין השנים 1989 עד 1995 (Deahl et al., 1995).
בשיטת AFLP אפשרה להפריד בין 74 זנים שנאספו מעלי תפוחי אדמה ועגבניות בשנים 1996-1997. בצרפת ובשווייץ, בשבע קבוצות. זני תפוחי האדמה ועגבניות לא היו שונים בבירור, אך זני ה"תפוח אדמה "היו מגוונים יותר מבחינה גנטית מאלה של ה"עגבניות". הראשונים נמצאו בכל שבעת האשכולות, והשניים, רק בארבעה, מה שמעיד על גנום מיוחד יותר של האחרון (Knapova and Gisi, 7).
6) מנגנוני בידוד. אם אוכלוסיות הטפיל על שני מיני צמחים מארחים מתפתחות לקראת צמצום ההתמחות למארח "שלהן", אזי נוצרים מנגנונים שונים לפני ואחרי המיאוטיות המונעים חילופי גנטיות בין אוכלוסיות (Dyakov ו- Lekomtseva, 1984).
מספר מחקרים בחנו את השפעת מקור זני ההורים על יעילות הכלאה. כאשר זנים מבודדים ממינים שונים מהסוג סולנום הוצלבו באקוודור (Oliva et al., 2002), נמצא כי זנים בסוג ההזדווגות A2 מזוגיות בר (קו משובט EC-2) חצו את הגרוע ביותר עם זנים מעגבנייה (קו EC -3), וחצה בצורה היעילה ביותר עם זן תפוחי האדמה (EC-1).
נמצא כי כל ההיברידיות אינן פתוגניות. המחברים מאמינים כי האחוז הנמוך של הכלאה והפחתת הפתוגניות בהיברידיות נובעים ממנגנונים פוסט-מיוטיים של בידוד רבייה של אוכלוסיות.
בניסויים של Bagirova et al. (1998) נחצה מספר גדול של זני תפוחי אדמה ועגבניות עם תכונות הגזעים T0 ו- T1. הצלבים הפוריים ביותר של זני T1xT1 המבודדים מעגבניה (36 oospores בשדה הראייה של המיקרוסקופ, 44% מהנבטת oospore), הפחות יעילים היו צלבים של גזעי T0xT1 מבודדים ממארחים שונים (מספר נמוך של oospores מתפתחים ונבטים, שיעור גבוה של oospores הפלות ולא מפותחות) ... היעילות של הצלבות בין מבודדי גזע T0 המבודדים מתפוחי אדמה הייתה בינונית. מכיוון שגוף הזנים העיקרי של מרוץ T0 משפיע על תפוחי אדמה, יש לו מקור אמין לחורף - פקעות תפוחי אדמה, וכתוצאה מכך החשיבות של oospores כיחידות זיהומיות חורפות לאוכלוסיות מתפוחי אדמה נמוכה. "צורת העגבניות" המותאמת מסוגלת לחורף על העגבנייה בצורת אוספורות (ראה להלן) ולכן שומרת על פרודוקטיביות גבוהה יותר של התהליך המיני. בשל פוריותו הגבוהה, T1 רוכש פוטנציאל עצמאי לזיהום ראשוני בעגבנייה. ניתן לפרש את התוצאות שהושגו על ידי Knapova et al. (Knapova et al., 2002) באותו אופן. צלבי הזנים המבודדים מתפוחי אדמה עם זנים עגבניות נתנו את המספר הגבוה ביותר של אוספורות - 13,8 למ"ר. בינוני (עם התפשטות של 5-19) ואחוז ביניים של נביטה של oospores (6,3 עם התפשטות של 0-24). מעברי זנים מבודדים עגבנייה נתנו את האחוז הנמוך ביותר של oospores (7,6 עם התפשטות של 4-12) עם אחוז הנביטה הגבוה ביותר שלהם (10,8). הצלבים בין הזנים המבודדים מתפוחי אדמה נתנו מספר ביניים של oospores (8,6 עם פיזור נתונים גבוה - 0-30) ואחוז הנביטה הנמוך ביותר של oospores (2,7). לפיכך, זנים מתפוחי אדמה פחות פוריים מאלו של עגבניות, אך צלבים בין אוכלוסיות לא הניבו תוצאות גרועות יותר מאלו שאינם אוכלוסיים. יתכן שההבדלים עם הנתונים שלעיל על ידי Bagirova et al. מוסברים על ידי העובדה שחוקרים רוסים עבדו עם זנים שבודדו בתחילת שנות ה -90 של המאה העשרים, וחוקרים שוויצרים - עם זנים שבודדו בסוף שנות ה 90.
הבסיס לפוריות נמוכה עשוי להיות ההטרופלואיד של הזנים. אם באוכלוסיות מקסיקניות, בהן התהליך המיני והזיהום הראשוני בצאצאי אוספורות הם קבועים, רוב הזנים הנחקרים של P. Infestans הם דיפלואידים, הרי שבארצות העולם הישן נצפו פולימורפיזם של פלואידיזם תוך אוכלוסייה (זנים די, טרי וטרפלואידים, כמו גם זנים הטרוקריוטיים עם גרעינים הטרופלידיים) , וזנים בעלי הזדווגות מסוגים שונים, כלומר פוריות הדדית, שונות במגוון הגרעיני (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). מגוון הגרעינים באנתרידיה ובאוגוניה יכול להיות הסיבה לפריון נמוך.
באשר לחילופי גרעין בין היפות במהלך אנסטומוזות, הדבר מונע על ידי חוסר תאימות וגטטיבי, המפרק אוכלוסיות לא-מיניות לשיבוטים רבים מבודדים גנטית (Poedinok and Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) התכנסות אוכלוסיות. הנתונים לעיל מצביעים על כך שהכלאה בין "תפוח אדמה" ל"עגבנייה "זנים P. infestans אפשרית. זיהום חוזר הדדי של מארחים שונים אפשרי גם הוא, אם כי עם תוקפנות מופחתת.
מחקר שנערך על סמני אוכלוסייה בבודדים משדות תפוחי אדמה ועגבניות סמוכים בשנת 1993 הראה כי כרבע מהמבודדים המבודדים מעלי עגבניות הועברו משדה תפוחי אדמה שכנה (Dolgova et al., 1997). תיאורטית, ניתן היה להניח שהסטייה של אוכלוסיות על שני מארחים תגדל ותביא להופעת צורות תוך-ספציפיות מיוחדות (f.sp. תפוח אדמה ועגבנייה f.sp.), במיוחד מכיוון שה- oospores יכולים להתמיד בפסולת צמחים (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) וזרעי עגבניות (Rubin et al., 2001). כתוצאה מכך, עגבניות יש כיום מקור להתחדשות האביב ללא תלות בפקעות תפוחי אדמה.
עם זאת, הכל קרה אחרת. חורף יתר באובוספורות אפשר לטפיל להימנע מהשלב הצר ביותר במעגל חייו - השלב הצומחי החד-מחזורי באדמה, במהלכו יורדות תכונות טפיליות, המוחזרות בהדרגה בשלב הפוליציקלי בקיץ.
טבלה 11. תדירות של גנים ארסיים לזנים המבדילים תפוחי אדמה בזנים P. infestans
מדינה | שנה | מספר ממוצע של גנים ארסיים בזנים | מחבר | |
מתפוחי אדמה | מעגבניה | |||
צרפת | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | לברטון, אנדרובון, 1998 | |
צרפת, שוויץ | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | קנאפובה, גיסי, 2002 |
ארצות הברית | 1989-94 | 5 | 4.8 | גודווין ואח ', 1995 |
ארה"ב, זאפ. וושינגטון | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
אקוודור | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | אויארזון ואח ', 1998 |
ישראל | 1998 | 7 | 4.8 | כהן, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
רוסיה, מוסק. אזור | 1993 | 8.9 | 6.7 | סמירנוב, 1996 |
רוסיה, אזורים שונים | 1995 | 9.4 | 8 | קוזלובסקאיה ואחרים. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
זואוספורנגיה ראשונית וזואוספורות, הנובטות אוספורות, הן בעלות פעילות גבוהה של טפילים, במיוחד אם האוספורות נוצרו באופן פרטנוגנטי בהשפעת פרומונים של זן עם הזדווגות מסוג הפוך. לכן, החומר המדבק על שתילי עגבניות הגדלים מזרעים הנגועים באוספורות הוא פתוגני ביותר הן לעגבנייה והן לתפוח אדמה.
שינויים אלה הובילו לשינוי אוכלוסייה נוסף, שהתבטא בשינויים החשובים הבאים מבחינה אפידמיולוגית:
- שתילי עגבניות נגועים הפכו למקור חשוב לזיהום ראשוני בתפוחי אדמה (פיליפוב, איווניוק, מסרים אישיים).
- באפיפיוטות על תפוחי אדמה החלו להתבונן כבר ביוני, כחודש מוקדם מהרגיל.
- בנטיעות תפוחי אדמה גדל אחוז מרוץ ה- T1, שנמצא שם בעבר בכמות לא משמעותית (Ulanova et al., 2003).
- זנים מבודדים מעלי עגבניות כבר לא היו שונים מזני תפוחי אדמה בארסיות על מבדילי תפוחי אדמה של גנים ארסיים והחלו לעלות על זני "תפוחי אדמה" באגרסיביות לא רק על עגבניות, אלא גם על תפוחי אדמה (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
לפיכך, במקום סטייה, הייתה התכנסות של אוכלוסיות, הופעת אוכלוסייה אחת על שני צמחים מארחים עם ארסיות גבוהה ותוקפנות לשני המינים.
מסקנה
לכן, למרות יותר מ -150 שנות מחקר אינטנסיבי של P. infestans, בביולוגיה, כולל ביולוגיית האוכלוסייה של גורם סיבתי זה של המחלות החשובות ביותר של צמחים סולניים מעובדים, הרבה נותר בלתי ידוע. לא ברור כיצד מעבר שלבים בודדים של מחזור החיים משפיע על מבנה האוכלוסיות, מהם המנגנונים הגנטיים של השונות התעלתית של אגרסיביות וארסיות, מה היחס בין מערכות הרבייה והריבוי המשובטים באוכלוסיות טבעיות, כיצד תורשתי חוסר תאימות וגטטיבי, מה תפקידם של תפוחי אדמה ועגבניות בזיהום הראשוני של יבולים אלה וב מהי השפעתם על מבנה האוכלוסייה של הטפיל. עד כה לא נפתרו נושאים מעשיים חשובים כמו המנגנונים הגנטיים לשינוי האגרסיביות של הטפיל או שחיקת עמידות לא ספציפית לתפוחי אדמה. עם העמקה והרחבת המחקר על הדלקת מאוחר בתפוחי אדמה, הטפיל מציב בפני החוקרים אתגרים חדשים. עם זאת, שיפור יכולות הניסוי, הופעתן של גישות מתודולוגיות חדשות למניפולציה עם גנים וחלבונים מאפשרים לנו לקוות לפיתרון מוצלח של השאלות שהוצגו.
המאמר פורסם בכתב העת "הגנה על תפוחי אדמה" (מס '3, 2017)