ד. יו. ריאזאנצב, א. מ. צ'ודינובה, ל. יו. קוקאבה, ס. נ. אלנסקי, פ. נ. בלבקו, ג. ל. בלובה, ס. ק. זברייב.
הפטרייה הפיטופתוגנית Colletotrichum coccodes גורמת למחלות מסוכנות בתפוחי אדמה ועגבניות המכונות אנתרקנוזה וכתם שחור פקעת. על פי מאפיינים מורפולוגיים, לעתים קרובות קשה להבדיל אותם ממחלות הנגרמות על ידי מיקרואורגניזמים אחרים; על פירות עגבניות ירוקות, המחלה עשויה להיות ללא תסמינים, והיא מתבטאת רק בפירות אדומים בשלים. לאבחון מהיר ומדויק של הפתוגן, מוצעת מערכת בדיקת PCR בזמן אמת. כדי לפתח מערכת בדיקה נקבע רצף הנוקליאוטידים של הגן הגליצרול טריפוספט דהידרוגנאז של 45 ג '. זני coccodes מבודדים מפקעות תפוחי אדמה באזורים שונים ברוסיה.
בהתבסס על התוצאות שהתקבלו וניתוח של רצפים דומים של מינים אחרים הזמינים במאגר המידע של GenBank, תוכננו הפריימרים הספציפיים למבחן לגופי קוקוס. כדי לבדוק את הספציפיות של מערכת הבדיקה שנוצרה, PCR בוצע עם DNA מבודד מתרבויות טהורות של 15 מינים שונים של פטריות טפיליות וספרוטרופיות הקשורות לצמחי עגבניות ותפוחי אדמה (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). נוכחותם של ה- DNA של קוקודים של Colletotrichum נקבעה במחזור סף של 20-27, בעוד מינים אחרים זוהו לאחר 40 מחזורים או לא זוהו. מערכת הבדיקה מאפשרת לזהות באופן מהימן ריכוזי DNA של coccodes בקוקודים העולים על 0.01 ng / mm3 בתערובת ה- PCR המנותחת. באמצעות מערכת הבדיקה המפותחת נבדקה נוכחותם של קוקודים מסוג C. בעלי עגבניות עם תסמינים של מחלות פטרייתיות ובפקעות תפוחי אדמה ללא תסמינים חיצוניים של המחלה. עלים עם תסמינים של זיהום פטרייתי נאספו משני שדות שונים באזור קרסנודר, פקעות - משדות באזור קוסטרומה, מוסקבה, קלוגה, ניז'ני נובגורוד. עלה עגבניות אחד המכיל DNA של coccodes DNA נמצא בשטח קרסנודר; נוכחות משמעותית של DNA של פתוגן זה התגלתה ב -5 דגימות של פקעות שגדלו באזורי קוסטרומה, מוסקבה, קלוגה.
מבוא
פטריות מהסוג Colletotrichum הן פיטופתוגנים מסוכנים המשפיעים על דגנים, ירקות, עשבי תיבול, פירות רב שנתיים וצמחי פירות יער. אחד המינים הנמצאים בכל מקום מסוג זה, Collcototrichum coccodes (Wallr).
יוז, הוא הגורם הסיבתי של אנתרקנוזה ונקודה שחורה של תפוחי אדמה ועגבניות, וגורם למחלות של מספר צמחים אחרים ממשפחת הסולניים, כולל. עשבים שוטים (דילארד, 1992). C. coccodes מדביק את כל החלקים התת קרקעיים של הצמח, בסיסי הגזע, העלים והפירות (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). על קליפת פקעות תפוחי האדמה הנגועים נצפתה התפתחות כתמים אפורים עם קצוות בולטים באופן לא ברור, שעליהן נראים בבירור נקודות שחורות של ספורולציה ומיקרוסקלורציה. במהלך האחסון, כיבים עם תוכן מרוכך יכולים להיווצר בעיסת הפקעות, כלומר. המחלה נכנסת לשלב אנתרקנוזה, אשר, עם זאת, הוא נדיר ביותר.
יחד עם זאת, הסימפטומים של אנתרקנוזה (כיבים בעור עם נקודות שחורות קטנות) אופייניים לפירות עגבניות. על העלים, הסימפטומים של C. coccodes מופיעים ככתמים חומים כהים, לרוב גובלים ברקמה צהובה (Johnson, 1994).
התפתחות הכתם השחור על הפקעות מקלקלת את המראה שלהם, וזה בולט במיוחד בעת מכירת תפוחי אדמה קליפת אדומה שטופים. פילינג לקלף מוביל לאידוי עודף ולהגדלת הפסדי האחסון (Hunger, McIntyre, 1979). נזק לאיברי צמחים אחרים מוביל לאובדן יבול, אשר צוין בשטח פתוח וסגור כאחד (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). מחלות הנגרמות על ידי קוקוס של C. שכיחות כמעט בכל האזורים המייצרים תפוחי אדמה בעולם, כולל רוסיה (Leesa, הילטון, 2003; Belov et al, 2018). השליטה במחלות אלו קשה עקב היעילות המספיקה של קוטלי פטריות קיימים כנגד קוקודים C. והיעדר זנים עמידים (Read, Hide, 1995).
חיסון C. coccodes יכול להימשך בפקעות זרעים (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), זרעי עגבניות (Ben-Daniel et al., 2010), לשרוד זמן רב בקרקע, על פסולת צמחים (Dillard, 1990 ; דילארד, קוב, 1993) ובעשבים שוטים (Raid, Pennypacker, 1987). עבודותיהם של מספר מחברים (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) הראו שהתפתחות המחלה בתפוחי אדמה ועגבניות תלויה במידה רבה בנוכחות חיסון בזרעים וב אדמה. לכן, כדי למזער את ההפסדים מהמחלה, יש צורך לאבחן (כולל כמותי) את התפשטות הפטרייה בחומר הזרע, באדמה, בפקעות תפוחי האדמה ובזרעי עגבניות שהונחו לאחסון. אבחון מורפולוגי בקרקע ובחומר צמחי יכול להתבצע רק על ידי נוכחות של מיקרוסקלרוטיה, אשר, עם זאת, נמצאים גם בסוגים אחרים של פטריות.
הסימפטומים על הפקעות דומים מאוד לגלד הכסוף הנגרם על ידי הפטרייה Helminthosporium solani. בידוד של קוקוסים של Colletotrichum ו- Helminthosporium solani לתרבות טהורה הוא די קשה ונמשך זמן רב בגלל הצמיחה האיטית במדיום התזונתי. כדי לזהות במהירות קוקודים של Colletotrichum, יש צורך להשתמש בשיטות אבחון אינסטרומנטליות. השיטה הנוחה ביותר היא תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ושינויו - PCR בזמן אמת. נכון לעכשיו, מערכת בדיקות שפותחה על ידי חוקרים בריטים (Cullen et al., 2002) לאזור ITS1 של rDNA משמשת באירופה ובארצות הברית. השימוש בו הראה תוצאות טובות בניתוח המבודדים הרוסים (Belov et al, 2018). עם זאת, C. coccodes משתנה מאוד וזיהויו מרצף DNA יחיד יכול להוביל לתוצאות שליליות שגויות. לצורך אבחון מהימן יותר, יש צורך לנתח כמה רצפי DNA ספציפיים למין, שבקשר אליהם פיתחנו מערכת בדיקה מקורית המאפשרת לנו לזהות C. coccodes לפי רצף הגן גלידרגיד-3-פוספט דהידרוגנאז.
חומרים ושיטות
כדי להעריך את היעילות והספציפיות של מערכות הבדיקה שנוצרו, השתמשנו בתרבויות טהורות של 15 מיני פטריות המבודדות על ידי המחברים מדגימות חולות של עלי עגבניות ופירות, פקעות תפוחי אדמה (טבלה 1). לצורך בידוד, לקחנו איברים של צמחים עם תסמינים של זיהום פטרייתי, לא יותר מאיבר אחד לכל שיח.
פרוסת פקעת עם קליפה, פרוסת פרי עגבניה ועלה מושפע הונחו תחת מיקרוסקופ דו-עיני, ולאחר מכן הועברו תפטיר, נבגים או פיסת רקמה למדיום אגר (אגר wort) בצלחת פטרי עם מחט לניתוח מושחזת. הבודדים אוחסנו במוט אגר במבחנות ב -4 מעלות צלזיוס.
דוגמאות של עלי עגבניות עם תסמינים של מחלות פטרייתיות המיועדות לניתוח הושמו מיד לאחר האיסוף (בשטח) ב -70% אלכוהול אתילי בו אוחסנו עד לבידוד ה- DNA. פקעות תפוחי אדמה הועברו למעבדה, קלפו (חתיכה 2 × 1 ס"מ) והוקפאו בטמפרטורה של -20 ° C. נשמר קפוא עד בידוד ה- DNA.
תרבויות פטריות טהורות לבידוד דנ"א גודלו במדיום אפונה נוזלי. התפטיר של הפטרייה הוסר מהמדיום הנוזלי, יבש על נייר סינון, הוקפא בחנקן נוזלי, הומוגני, הודגר במאגר CTAB, טוהר עם כלורופורם, הושקע בתערובת של איזופרופנול ו- 0.5 M אשלגן אצטט, נשטף פעמיים עם 2% אלכוהול. ה- DNA שהתקבל הומס במים ללא יונים ואוחסן בטמפרטורה של -70 ° C (Kutuzova et al., 20). ריכוז ה- DNA נמדד באמצעות ערכת כימות HS DNA עבור DNA כפול גדילי ב- Qubit 2017 (Qiagen, גרמניה). הדגימות האלכוהוליות והקפואות חולצו בחנקן נוזלי, ואז בוצעה מיצוי DNA באותו אופן כמתואר לעיל (עבור התפטיר של תרביות פטרייתיות טהורות).
טבלה 1. מקור זני הפטריות המשומשים
שם פטריות | צמח, איבר | מקום הבחירה |
---|---|---|
קוקודים של Colletotrichum 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | פקעת תפוחי אדמה | אזור קוסטרומה, פקעות תפוחי אדמה מדור השדה הראשון, הזן האדום סקרלט |
קוקודים של Colletotrichum 4 | עלה תפוחי אדמה | נציג מארי אל, יושקר-אולה |
הלמינטוספוריום סולאני | פקעת תפוחי אדמה | אזור מגאדן, pos. אוהל, פקעת תפוחי אדמה |
Cladosporium fulvum | עלה עגבניות | אזור מוסקבה, עגבניה עם פירות גדולים |
עגבניות אלטרנטריה | פרי עגבניות | הוגש על ידי צוות המעבדה למיקולוגיה ופיטופתולוגיה של מכון המחקר הכל-רוסי להגנת הצומח |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | פרי עגבניות | טריטוריה קרסנודר, מחוז קרימסקי, קרם כיתה |
Fusarium oxysporum | שורש חיטה | אזור מוסקבה |
PCR בוצע על מגבר DTprime (DNA-Technology). עבור PCR, נעשה שימוש בפריימרים מקוריים ובדיקה לאזור הספציפי למין גן הדהידרוגנאז של גליצרול טריפוספט: פריימר קדימה Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, פריימר הפוך Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. הפריימרים מגבירים אזור של 213 bp.
התגובה לקחה 50 ננוגרם של ה- DNA הכולל (בעת ניתוח עלים ופקעות) ו -10 ננוגרם (בעת ניתוח דנ א של תרביות פטרייתיות טהורות). תערובת התגובה (35 μl) הופרדה על ידי שכבת פרפין לשני חלקים: התחתון (20 μl) הכיל 2 μl של 10 × מאגר תגובה (750 מ"מ טריס- HCl, pH 8.8; 200 מ"מ (NH4) 2SO4; 25 מ"מ MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 מ"מ מכל טריפוספט דו-אוקסינוקליאוטידי, 7 pmol מכל פריימר ו -4 pmol של חלון פלואורסצנטי הידרוליזי; זה העליון הכיל 1 μl של מאגר 10 × PCR ו- 1 U של פולימראז טאק.
הפרדת התערובת עם פרפין מאפשרת לשמור את הצינורות לאורך זמן בטמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס ולספק התחלה חמה ל- PCR לאחר חימוםם למשך 10 דקות בטמפרטורה מעל 80 מעלות צלזיוס. PCR בוצע על פי התוכנית הבאה: 94.0 מעלות צלזיוס - 90 שניות (מחזור אחד); 1 מעלות צלזיוס - 94.0 שניות; 30 מעלות צלזיוס - 64.0 שניות (15 מחזורים); 5 מעלות צלזיוס - 94.0 שניות; 10 מעלות צלזיוס - 64.0 שניות (15 מחזורים); 45 מעלות צלזיוס - אחסון.
תוצאות ודיון
רצפי הגן של גליצרול טריפוספט דהידרוגנאז נקבעו ב -45 זנים מבודדים מעלים, גבעולים, פקעות תפוחי אדמה ופירות עגבניות (Kutuzova, 2018) באזורים שונים ברוסיה. הרצפים הנחקרים של כל הזנים חולקו לשתי קבוצות שונות בשני נוקלאוטידים. רצפי הנוקליאוטידים של נציגי שתי הקבוצות תחת המספרים KY2 ו- KY496634 מופקדים ב- GenBank.
הפריימרים coc70gdf, coc280gdr ובדיקת cocgdz שתוכננו על בסיסם נבדקו באמצעות תוכנית BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) על כל הרצפים של הגן הגליצרול טריפוספט דהידרוגנאז של מינים מהסוג Colletotrichum ואורגניזמים אחרים הזמינים במאגר GenBank.
לא נמצאו אזורי DNA של אורגניזמים אחרים הומולוגיים מאוד לתחלילים ולבדיקות.
רגישותה של מערכת הבדיקה נבדקה באמצעות דגימות עם ריכוזים שונים של ה- C. coccodes DNA, DNA של עלה תפוחי אדמה נגוע באנתרקנוזה (נאסף בשנת 2017 במרי אל, זן אדום סקרלט) וקליפת פקעות שנפגעו מכתם שחור (שנאסף באזור קוסטרומה מגוון אדום סקרלט, טבלה 2). כדי לאשר את קיומו של DNA בפקעות ובעלי תפוחי האדמה, בודדו מהם זני C. coccodes לתרבויות טהורות.
תוצאות ניתוח הרגישות של מערכת הבדיקות מראות כי ניתן להשתמש בה בכדי לאבחן בהצלחה נוכחות של C. coccodes DNA במדגם כאשר התוכן הכולל שלו בתערובת PCR הוא יותר מ- 0.05 ng. זה די מספיק לגילוי, מכיוון שסקלרוטיה אחת מכילה, בממוצע, 0.131 ננוגרם, ונבג אחד מכיל כ -0.04 ננוגרם של DNA (Cullen et al., 2002). מערכת הבדיקות שפיתחה הקבוצה הבריטית (Cullen et al., 2002) הראתה רגישות דומה (מחזור סף 34 ב -0.05 ננו-די-אן-אי ו -37 ב -0.005 ננוגרם).
ניתוח של דגימות טבעיות המכילות C. coccodes בכל המקרים אפשר לחשוף באופן מהימן את נוכחותו במדגם (טבלה 2). השיטה המוצעת לבידוד DNA הייתה ישימה גם לניתוח דגימות צמחים טבעיות.
טבלה 2. קביעת הרגישות של מערכת הבדיקה המוצעת לזיהוי קוקודים של Colletotrichum ל- PCR בזמן אמת
המדגם | כמות DNA במדגם *, נג | מחזור סף | C. זיהוי קוקודים |
---|---|---|---|
תאי מיצליום Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
קליפת פקעת 1 | 50 | 32 | + |
קליפת פקעת 2 | 50 | 30 | + |
קליפת פקעת 3 | 50 | 31.5 | + |
עלה תפוחי אדמה | 50 | 29.5 | + |
הערה. * בתערובת של מוצרי PCR.
הספציפיות של מערכת הבדיקה נבדקה על דגימות DNA שהופקו מ -15 מינים של פטריות. כל זני הפטריות בודדו על ידי הכותבים מפירות ועלים מושפעים ובריאים של עגבניות, פקעות תפוחי אדמה; זן אחד בודד משורש החיטה (טבלה 1). בין המינים המבודדים מעל פני הפרי, ישנם גם מינים שאינם פתוגניים לעגבנייה (למשל, Phellinus ferrugineovelutinus).
מחקרים הראו ש- C. coccodes DNA זוהה במחזור סף של 20-27, בעוד מינים פטרייתיים אחרים לא אותרו או נתנו אות לאחר מחזור 40, שניתן לייחס אותו לאפקט רעש לא ספציפי (טבלה 3).
טבלה 3. בדיקת מערכת הבדיקה לגבי סוגים שונים של פטריות
שם פטריות | מחזור סף |
קוקודים של Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. קוקודים 2 | 22.6 |
C. קוקודים 3 | 23 |
C. קוקודים 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
פומופסיס פאזולי | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. עגבניות | > 40 |
הלמינטוספוריום סולאני | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
סי פולווום | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium Sp. | > 40 |
הערה. * כמות ה- DNA בכל הדגימות הייתה 10 ננוגרם.
מערכת הבדיקות שפותחה שימשה לזיהוי C. coccodes בדגימות עלים עגבניות עם תסמינים של פתוגנים נמקיים ופקעות תפוחי אדמה ללא זרעים. לצורך המחקר לקחנו פקעות זרעים מזנים שונים שגדלו באזורי קוסטרומה, מוסקבה, קלוגה, ניז'ני נובגורוד. נוכחותם של ה- DNA של coccodes ב- C. נחשבה משמעותית בדגימות, שבניתוחן מחזור הסף לא עלה על 35. ערך סף זה נבחר על סמך הקביעה המהימנה של 0.05 ng של ה- DNA של coccodes. במחזורי סף מעל 33.5 אובחן DNA לא ספציפי של מינים פטרייתיים אחרים. עם גישה זו, זוהתה נוכחותם המשמעותית של ה- C. coccodes DNA בחמש דגימות של פקעות שגדלו באזור קוסטרומה, מוסקבה, קלוגה ובעלה עגבניות אחד ממחוז ייסק באזור קרסנודר (לוחות 2, 40).
טבלה 4. איתור קוקודים של Colletotrichum על פקעות תפוחי אדמה *
מספר לדוגמא | מגוון תפוחי אדמה | מקום גידול | C. זיהוי קוקודים | מחזור סף |
---|---|---|---|---|
1 | ארגמן אדום | אזור קוסטרומה | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | סנטה | אזור מוסקבה | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | ז'וקובסקי מוקדם | אזור מוסקבה | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | מולי | אזור קלוגה | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | פנטזיה | אזור קלוגה | - | |
15 | גאלה | אזור ניז'ני נובגורוד. | - | |
16 | - |
הערה. * כמות ה- DNA בכל הדגימות הייתה 50 ננוגרם.
טבלה 5. איתור קוקודים של Colletotrichum על עלי עגבניות *
מספר לדוגמא | מקום גידול | C. זיהוי קוקודים | מחזור סף |
---|---|---|---|
1 | שטח קרסנודר, מחוז קרים | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | אזור קרסנודאר, מחוז ייסק | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* כמות ה- DNA בכל הדגימות הייתה 50 ננוגרם.
מערכת הבדיקה שנוצרה על ידינו אינה נחותה מזו שפיתחו חוקרים בריטים (Cullen et al., 2002) ברגישות ובספציפיות והיא מתאימה לניתוח דגימות צמחים. יישומו לניתוח פקעות זרעים אפשר לזהות את ה- DNA של coccodes ב- פקעות ללא סימני נזק חיצוניים ולנתח בהצלחה זיהום עלים.
עד כה לא נערך ברוסיה ניתוח של פקעות תפוחי אדמה להדבקה של קוקודים של C. המחקר הראשון שלנו הראה שמתוך 16 פקעות זרעים שנבדקו שגדלו באזורים שונים של הפדרציה הרוסית, 5 מכילות קודים של C. זה מראה כי נקודה שחורה של פקעות תפוחי אדמה היא מחלת תפוחי אדמה שכיחה ברוסיה, ותפקידם בהפחתת נפח ואיכות יבול תפוחי האדמה זולזלזל.
ניתוח עלי העגבניות גילה נוכחות משמעותית של ה- DNA של coccodes ב- C. בעלה אחד ממחוז ייסק בשטח קרסנודר. מוקדם יותר, כאשר בחנו שדות עגבניות בדרום רוסיה באמצעות שיטת הבדיקה הבריטית (Cullen et al., 2002), נמצאו עלים המכילים C. coccodes, ובשדות מסוימים נמצא שיעור גבוה של עלים הנגועים ב- C. coccodes (Belov et al., 2018). בשטחי קרסנודר ופרימורסקי, אזור מוסקבה, מצאנו פירות עגבניות, מהם הצלחנו לבודד תרבויות טהורות של קוקודים C. יתכן שקוקודים של C. נפוצים הרבה יותר בעגבניות ברוסיה ממה שמאמינים כיום, ומזלזלים גם בזיקות שלה.
לפיכך, עד היום הצטבר מספיק מידע על תפוצתם הנרחבת של קוקוס C. על תפוחי אדמה ועגבניות.
כדי להבין טוב יותר את תפקידה של פטרייה זו בהתפתחות מחלות תפוחי אדמה ועגבניות, נדרש ניטור נרחב של שכיחותה ברוסיה, מחקר על תפקיד זיהום האדמה והזרעים ותפקידו של הנקודה השחורה באיבודים במהלך האחסון. השימוש באבחון PCR יכול להקל משמעותית על עבודה זו, והשימוש בו זמנית בשתי מערכות הבדיקה יגדיל משמעותית את דיוק הניתוח.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מס '18-76-00009 של קרן המדע הרוסית.
המאמר פורסם בכתב העת "מיקולוגיה ופיטופתולוגיה" (כרך 54, מספר 1, 2020).