לאכול. Chudinov, V.A. פלטונוב, A.V. אלכסנדרובה, ס.נ. אלנסקי
לאחרונה הוכח כי פטריית ascomycete Ilyonectria crassa מסוגלת להדביק פקעות תפוחי אדמה. עבודה זו היא הראשונה לנתח את המאפיינים הביולוגיים ואת ההתנגדות לכמה קוטלי פטריות מזן I. crassa מבודד מתפוחי אדמה. רצפי האזורים הספציפיים למין של זן "תפוחי האדמה" חפפו את אלו שהושגו קודם לכן לפטריות המבודדות משורשי הנרקיס, הג'ינסנג, האשור והאשור, נורות השושן ועלי הצבעונים. ככל הנראה, צמחי בר וגינה רבים יכולים להיות שמורות של I. crassa. הזן שנחקר נגוע בפרוסות עגבניות ותפוחי אדמה, אך לא הדביק את כל פרי העגבניות ופקעת תפוחי האדמה השלמים. זה מראה ש- I crassa הוא טפיל פצע. הערכת עמידות לפלודיוקסוניל, דיפנוקונאזול ואזוקסיסטרובין במדיום תזונתי הראתה יעילות גבוהה של תרופות אלו.
אינדיקטור EC50 (ריכוז הקוטל הפטרייתי, המאט פי 2 את קצב הצמיחה הרדיאלית של המושבה ביחס לשליטה ללא פטריות) היה שווה ל 0.4; 7.4 ו -4 מ"ג / ליטר, בהתאמה. יש לקחת בחשבון את האפשרות להתפתחות המחלה הנגרמת על ידי I. crassa בעת הערכה פיטופתולוגית של פקעות תפוחי אדמה ופיתוח אמצעי הגנה מפני צמחים.
התפתחותם של מיקרואורגניזמים פיטופתוגניים מובילה להפסדים גבוהים בכל שלבי גידול ואחסון תפוחי האדמה. בעת תכנון אמצעי הגנה, ככלל, לוקחים בחשבון פתוגנים ידועים, כגון מיני הסוגים Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora וכו '. עם זאת, בשנים האחרונות הופיעו יותר ויותר דיווחים על הופעתם של מיקרואורגניזמים פיטופתוגניים חדשים על תפוחי אדמה. הביולוגיה שלהם נחקרה בצורה גרועה, יעילותם של קוטלי פטריות המשמשים לתפוחי אדמה ביחס אליהם אינה ידועה, שיטות אבחון לא פותחו. עם התפתחות המונית הם מסוגלים לגרום נזק משמעותי לגידול תפוחי האדמה. אחד המיקרואורגניזמים הללו הוא פטריית ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, שהתגלתה לראשונה על ידי המחברים על פקעות תפוחי אדמה (Chudinova et al., 2019).
עבודה זו מציגה את תוצאות הניתוח של זן I. crassa מבודד פקעות תפוחי אדמה. נחקרה המורפולוגיה של מושבות ומבנים תאי שריריים של I. crassa, רצפי נוקלאוטידים של אזורי DNA ספציפיים למין, ארסיות לתפוחי אדמה ועגבניות והתנגדות לכמה קוטלי פטריות פופולריים.
חומרים ושיטות
השתמשנו בזן I. crassa 18KSuPT2 מבודד בשנת 2018 מפקעת תפוחי האדמה הנגועה שגדלה באזור קוסטרומה. הפקעת נפגעה מסוג ריקבון יבש עם חלל מכוסה בתפטיר חום בהיר. באמצעות מחט לניתוח סטרילי, התפטיר הפטרייתי הועבר לצלחת פטרי עם מדיום אגר (בורט wort 10%, אגר 1.5%, פניצילין 1000 U / ml). הצלחות הודגרו בחושך ב 24 מעלות צלזיוס.
מיקרוסקופ אור לייקה DM2500 עם מצלמה דיגיטלית ICC50 HD ומיקרוסקופ משקפת לייקה M80 עם מצלמה דיגיטלית IC80HD (Leica Microsystems, גרמניה) שימשו לצילום, הערכת גודל ומורפולוגיה של נבגים ואיברים נבגים.
כדי לבודד את ה- DNA גידלו את התפטיר הפטרייתי במדיום אפונה נוזלי, ואז הוקפא בחנקן נוזלי, הומוגני, הודגר במאגר CTAB, טוהר עם כלורופורם ונשטף פעמיים עם 2% אלכוהול.
שיטת חילוץ ה- DNA מתוארת בפירוט במאמרם של Kutuzova et al. (2017).
כדי לקבוע את המין בשיטות מולקולריות ולהשוות עם זנים ידועים אחרים של I crassa, PCR בוצע עם פריימרים שאפשרו הגברה של אזורי DNA ספציפיים למין: ITS1-5,8S-ITS2 (פריימרים ITS5 / ITS4, White et al., 1990), אזורי גן b טובולין (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) וגורם התארכות התרגום 1α (tef1α) (פריימרים EF1-728F / EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999). אמפליונים באורך הרצוי חולצו מהג'ל באמצעות ערכת ניקוי Evrogen. האזורים המוגברים הועברו ברצף באמצעות ערכת רצף המחזור של BigDye® Terminator v3.1 (יישומי ביוסיסטמס, קליפורניה, ארה"ב) על רצף אוטומטי יישומי ביוסיסטמס 3730 xl (אפלייד ביוסיסטמס, קליפורניה, ארה"ב). רצפי הנוקליאוטידים שהתקבלו שימשו לחיפוש התאמה במאגר GenBank של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי בארה"ב (NCBI). ניתוח פילוגנטי בוצע באמצעות תוכנית MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
קביעת הארסיות בוצעה על פירות ירוקים שלמים של עגבנייה פירותית גדולה (זן דוברבה) ופקעות תפוחי אדמה (זן גאלה). בנוסף, כדי לדמות נזק לפירות ופקעות שנפגעו, השתמשנו בפרוסות של אותם פירות ופקעות. פרוסות פקעות הונחו בתאים לחים, שהיו כלי פטרי שבתחתיתם נייר סינון רטוב. על הנייר הונחה שקופית שעליה הונחו פרוסות פקעות או פירות. פקעות שלמות ופירות הונחו גם במיכלים שבתחתיתם נייר סינון רטוב. במרכז הנתח (או על המשטח השלם של הפקעת או הפרי), הונחה חתיכת אגר (5 × 5 מ"מ) עם היפות פטרייתיות לאחר 5 ימי גידול על אגר wort.
הערכת העמידות של זנים פטרייתיים בפני קוטלי פטריות בוצעה בתנאי מעבדה על מדיום מזין אגר. בחנו את הרגישות לתרופות קוטלות פטריות Maxim, KS (החומר הפעיל fludioxonil, 25 גרם / ליטר), Quadris, KS (אזוקסיסטרובין 250 גרם / ליטר), Scor, EC (difenoconazole 250 גרם / ליטר) (קטלוג המדינה ..., 2020). ההערכה בוצעה בצלחות פטרי על מדיום אגר-wort בתוספת התרופות שנחקרו בריכוזים של החומר הפעיל 0.1; אחד; 1 עמודים לדקה (מ"ג / ליטר) (לפלודיוקסוניל ולדיפנוקונזול), 10; עשר; 1 עמודים לדקה (לאזוקסיסטרובין) ובמדיה ללא קוטל פטריות (שליטה). קוטל הפטריות התווסף למומס והתקרר למדיום של 10 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן המדיום נשפך לכלי פטרי. בלוק אגר עם תפטיר פטרייתי הונח במרכז צלחת פטרי ותורבת בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר 60 ימי דגירה נמדדו קוטר המושבות בשני כיוונים בניצב זה לזה; תוצאות המדידה עבור כל מושבה היו ממוצעות. הניסויים בוצעו בשלושה עותקים. בהתבסס על תוצאות הניתוחים, חושבה ה- EC24, שווה לריכוז קוטל הפטריות, שהקטין את קצב הצמיחה הרדיאלי של המושבה ביחס לשליטה בקוטל.
תוצאות ודיון
על צלחות פטרי עם אגר wort, הפטרייה יצרה מושבות עם תפטיר לבן פלואקטיבי. המדיום מתחת לתפטיר הפך לחום-אדמדם. כאשר המדיום מתייבש, הפטרייה יצרה נבגים משני סוגים על קונידיופורים בודדים ומצטברים בספורודוכיה קטנה. מקרוקונידיה מאורכת, גלילית, עם מחיצות אחת עד שלוש, אורך ממוצע 27.2 מיקרומטר עם טווח ערכים בין 23.2 ל -32.2 מיקרומטר, רוחב - עד 4.9 מיקרומטר (איור 1). האורך הממוצע של מיקרוקונידיה הוא 14.3 מיקרומטר עם טווח ערכים בין 10.3 ל 18.1 מיקרומטר, הרוחב הוא עד 4.0 מיקרומטר. כל התווים המאקרו והמיקרומורפולוגיים משתלבים בטווח השונות של המינים Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
רצפי אזורי ה- DNA הספציפיים למין (ITS, b-tubulin, TEF 1α) חופפים לחלוטין את רצפי זני ה- I. crassa שחקרנו קודם (Chudinova et al., 2019, טבלה 1). כדי לחקור את שכיחות I. crassa באזורים אחרים ולנתח את ספקטרום התרבויות המושפעות, נותחו רצפי DNA אנלוגיים במאגר GenBank (טבלה 1). החפיפה הייתה 86 עד 100%. הרצפים של כל שלושת אזורי ה- DNA של זן "תפוח האדמה" I. Crassa היו זהים לרצפי הזנים המבודדים מנורת השושן ושורשי הנרקיס בהולנד ומשורש הג'ינסנג בקנדה. לא הצלחנו למצוא זני I. crassa אחרים עם שלושה רצפים דומים שניתחו במאגרי מידע פתוחים. עם זאת, ניתוח של רצפי ה- ITS וה- b-tubulin שהופקדו הראה את נוכחותם של I. crassa על עלי צבעונים בבריטניה. פטריות עם רצף ITS דומה זוהו בניתוח המיקוביוטה של שורשי האספן בקנדה ושורשי האשור באיטליה, פקעות תפוחי אדמה בערב הסעודית (טבלה 1). תוצאות מחקר זה מראות כי ל- I. crassa יש תפוצה עולמית והיא מסוגלת להדביק מיני צמחים שונים.
בעת קביעת הפתוגניות על פרוסות עגבנייה ותפוח אדמה ביום החמישי, קוטר הנגע הגיע ל -5 ס"מ. הזן הנחקר לא הדביק את כל פרי העגבניות ואת פקעת תפוחי האדמה השלמה. עם זאת, הגביעים הושפעו מהעגבנייה. כדי לא לכלול את האפשרות של זיהום מהתפטום שהתפתח על פרוסת פקעת תפוחי האדמה, בודד בידוד פטרייתי לתרבית טהורה. זה היה זהה לחלוטין למתח ההורי. ככל הנראה, אני קראסה הוא טפיל פצע.
טיפול לפני שתילה בפקעות זרעים עם קוטלי פטריות מפחית התפתחות מחלות על צמחים בעונת הגידול. לבחירת קוטלי פטריות יעילים, חשוב להעריך מי מהם יעיל כנגד I. сrassa. העבודה בחנה את החומרים הפעילים הנרחבים של קוטלי פטריות - פלודיאוקסוניל, אזוקסיסטרובין, דיפנוקונאזול. פלודיאוקסוניל מנוסח בכמה תערובות המשמשות להלבשת זרעים ופקעות זרעים לפני השתילה. Fludioxonil (Maxim) משמש גם לטיפול בפקעות זרעים לפני האחסון. Difenoconazole ו- azoxystrobin כלולים גם במספר תכשירים המשמשים לעיבוד חומר זרעים, וכן בתכשירים המיועדים לעיבוד צמחים צמחיים (קטלוג מדינה ..., 2020).
קצב הגידול של I. crassa נחקר על מדיה (איור 2) עם ריכוזים שונים של חומרים פעילים: פלודיאוקסוניל (EC50 = 0.4 עמודים לדקה), אזוקסיסטרובין (EC50 = 4 עמודים לדקה) ודיפנוקונאזול (EC50 = 7.4 עמודים לדקה) (טבלה 2). תכשירים אלה יכולים להיחשב יעילים ביותר כנגד I. crassa, מכיוון שה- EC50 שלהם נמוך משמעותית מהריכוז המומלץ של התכשיר בנוזל העבודה המשמש לטיפול בפקעות. על פי הקטלוג הממלכתי ... (2020), ריכוז הפלודיוקסוניל בנוזל לטיפול בפקעות תפוחי אדמה הוא בין 500 ל -1000 עמודים לדקה, אזוקסיסטרובין (בנוזל לטיפול בתחתית התלם) - 3750-9375 עמודים לדקה, דיפנוקונאזול (בנוזל לטיפול בצמחים צמחיים) - 187.5– 625 עמודים לדקה.
טבלה 1. דמיון של רצפים של רצפים ספציפיים למין של זן 18KSuPT2 וזנים של Ilyonectria crassa הזמינים במאגר Genbank
מתח | צמח מארח, אתר הפרשה | מס 'רצפים שהופקדו ב- GenBank, אחוז הדמיון | קשר | ||
שֶׁלָה | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 ו- 18KSuPT2 | פקעת תפוחי אדמה, אזור קוסטרומה | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, עבודה זו |
הלמ"ס 158/31 | שורשי נרקיס, הולנד | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | קברל ואח ', 2012 |
הלמ"ס 139/30 | נורת שושן, הולנד | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | שורש ג'ינסנג, קנדה | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | עלה צבעוני, בריטניה | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | דנטון, דנטון, 2014 |
MT294410 | שורשי האספן, קנדה | MT294410 100 | ND | ND | רמספילד ואח ', 2020 |
ER1937 | אשור, איטליה | KR019363 99.65 | ND | ND | טיזאני, האגי, מוטה. הגשה ישירה |
KAUF19 | פקעת תפוחי אדמה, ערב הסעודית | HE649390 98.3 | ND | ND | גשגרי, גרבווי, 2013 |
ND = לא הופקד
טבלה 2. עמידות של Ilyonectria crassa בפני קוטלי פטריות
(חומר פעיל) | EC50, עמודים לדקה | ||||
3 יום | 5 יום | 7 יום | |||
לשלוט | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
מקסים, KS (פלודיוקסוניל) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazole) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
בעבודתנו, מבודדים זני I. crassa מפקעות תפוחי אדמה באזורי קוסטרומה ומוסקבה (Chudinova et al., 2019). שיעור גבוה של זנים פטרייתיים עם רצפי ITS זהים ל- I. crassa התגלה בעת ניתוח המיקוביוטה של פקעות תפוחי אדמה בערב הסעודית (Gashgari and Gherbawy, 2013). ככל הנראה, I crassa אינו נדיר בתפוחי אדמה כפי שהוא עשוי להיראות. הניסויים שלנו הראו שהפטרייה עלולה להדביק פירות עגבניות פגומים. מן הספרות ידוע כי I. crassa מסוגל להתפתח באדמה באופן ספרוטרופי (Moll et al., 2016), וכן להשפיע על מגוון צמחים, אפילו רחוקים מבחינה טקסונומית כמו נרקיסים, חבצלות, ג'ינסנג, אספן ואשור (לוח 1). אחד). ככל הנראה, צמחי בר וגינה רבים יכולים להיות שמורות של I. crassa. האמור לעיל מראה כי בעת פיתוח אמצעי הגנה, יש לקחת בחשבון את האפשרות להשפיע על פקעות תפוחי אדמה עם פטרייה זו. תכשירים נרחבים לטיפול בפקעות תפוחי אדמה המכילים פלודיאוקסוניל, אזוקסיסטרובין ודיפנוקונאזול הראו יעילות גבוהה של קוטלי פטריות כנגד I. crassa.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הרוסית למחקר בסיסי (מענק מספר 20-016-00139).
המאמר פורסם בכתב העת "עלון הגנת הצומח", 2020, 103 (3)